（基因功能 & 基因表达调控）研究方案
做了好久的RNA-seq分析，基因表达也在口头溜了几年了，但似乎老是浮在表面。
对一件事的了解程度决定了你的思维深度，只想做技工就不用想太多，想做大师就一定要刨根问底。
老是说基因表达，那么什么是基因表达？我们测序得到的基因表达其实只是一种表型，是样本的一个快照，和普通的身高体重之类的连续型表型类似。
常规的转录组分析本质上都是表型分析，clustering、pseudotime、DEG、marker，在这些分析中，每个基因都是独立的维度，属于静态的分析，此时我们关注的是某个基因的功能分析，比如RET，功能已经明确，那就可以用基因表达这个表型来解释另一个表型。
高通量测序还会有后续的分析，几万个基因不可能一个一个的研究，GO和KEGG分析就来了，基因不是互相独立的，GO term和pathway的概念就来了。GO和KEGG的本质是规范了基因之间的关系。GO整合了所有物种，是从生命系统的角度来统一基因的关系，这种关系只是一个集合；KEGG是针对一个物种来界定基因之间的关系，这种关系是有向图结构。必须再深入了解GO和KEGG的制作原理，暂时不深入。此时我们开始区分基因类型，蛋白编码、非编码、转录因子。在这个阶段我们更关注的是基因之间的调控关系。
中心法则揭示了生命系统的层级和管道结构，和计算机的通信系统很类似，就算上游的基础调控再复杂，下游的蛋白都是决定性因素，所以令人惊叹的是上游调控如此复杂多变，可下游的蛋白确是非常稳定，这说明复杂多变的调控是非常稳定的。
基因研究的第一步必然是基因的功能，其次才是基因的调控。
基因功能
那么如何研究一个基因的功能呢？参考：＃基因组观＃基因功能研究的“七大绝招”与“三板斧” - BioinforCN
简单总结一下这篇文章：
1. 天地人和，研究基因表达的时空规律来推测功能，这和侦探调查是一样的，属于间接推理；
2. 患得患失，就是直接操作基因，knock out或down或overexpress，来直接探索基因的功能，属于直接观察；
3. 上下求索，因为中心法则是个层级和管道系统，上下游十分明确，从基因的DNA、RNA到蛋白质，一起研究；
4. 十面埋伏，立体论证，做生物的很容易观察到假阳性，必须多角度论证；
5. 其他的，misexpression、in vitro/vivo。
不说人类hs了，假设你负责一个全新的物种的基因组和基因功能研究，你如何找到该物种的所有基因呢？
看任何一篇基因组组装文章都能找到解决方案。那我们就看看严建兵的最新的玉米的NG吧，Genome assembly of a tropical maize inbred line provides insights into structural variation and crop improvement。
微信文章：《Nature Genetics》| 玉米产量相关基因找到了 | 热带玉米基因组及高精度结构变异图谱成功构建，助力玉米遗传改良
首先是基因组DNA的组装，Genome sequencing, assembly and scaffolding，这部分纯技术，以后估计都不要组装了，直接把基因组测出来；
其次就是基因组注释了，Genome annotation，这部分是我们现在最感兴趣的部分，如何找到一个新物种内的所有基因？
A comprehensive strategy combining de novo gene prediction, protein-based homology searches, RNA sequencing (RNA-Seq) and isoform sequencing (Iso-Seq) of nine tissues (Supplementary Table 6) was used to annotate the genes (Supplementary Fig. 7).
方案来了：
1. 基因是有特殊结构的，所以只要有DNA序列，就可以做denovo预测；
2. 中心法则告诉我们DNA、RNA和蛋白质是环环相扣的，所有测RNA-seq和iso-seq可以间接推出基因；
3. 蛋白测序还没有普及，所以目前都用的同源蛋白序列来反推；
这样注释出来的只是很general的基因注释，能cover绝大多数基因，但某些特殊结构的肯定无法注释出来。
有了草图，后面再做实验的功能研究就会方便很多。
基于高通量测序的前两步只能告诉你基因组的这个地方是个基因，但是不可能告诉你它的功能；第三步就是基于已有的知识了，做同源推理。所以目前来看所有的生物知识都是来源于实验的，测序只是一个加速的辅助手段而已。
可以没有测序，但是不能没有实验，测序是科研加速的催化剂。
文章结果：
GENE FINDING METHODS - broad institute - 很全面
基因表达调控/转录调控
教科书解释：
- 染色体和染色质水平的结构变化，导致基因活性变化；Hi-C，bulk平均好些，sc的量太少不靠谱
- 转录水平调控；转录因子，enhancer，promoter，ncRNA
- RNA加工水平调控，剪切修饰编辑降解；甲基化，lncRNA抑制降解
- 转录后，细胞核向细胞质转运；HDAC4
- 翻译水平；
- 蛋白合成水平；蛋白修饰定量，不是AA测序
目前最火的两个可以用高通量测序研究的调控方法：
- 转录因子，enhancer，promoter
- 非编码RNA，lncRNA、miRNA、ceRNA
参考：
Modes of transcriptional regulation
Transcriptional Regulation and Its Misregulation in Disease
项目问题：
现在in vivo和in vitro模型都已成熟，RNA-seq成本大家都可以接受了，CRISPR技术也成熟了，KO一个基因已经变得非常容易，现在发育生物学、生物医学等都在这么做：KO一个基因，来探索自己感兴趣的生物过程发生了哪些变化。
现在问题来了，KO后表型肯定发生了变化，那么如何把这个表型和基因表达和调控联系到一起呢？
这是一个general的问题，解答好了可以用于任意一个基因的深入研究。
大体解决方案：
假设检验是科研获取真知的唯一手段，首先我们必须要一个合理的假设，然后去寻找各种证据来test这个假设。
没有假设和验证就不是做科研，那就是一个技工得出一份没有意义的结题报告。
问题：
1. RNA-seq的建库方案有哪些？ployA、随机等。只抓有polyA的MRNA会有哪些优势和缺点？ployA只有mRNA有，所以polyA建库只能抓到蛋白编码基因，很少部分地ncRNA。参见链接
2. 细胞核和全部测序的区别？
3. 基因的长度差别到底有多大？
4. 可变剪切和isoform是如何影响蛋白的？
5. KEGG里面已经有基因的关系了，为什么我们还要研究基因调控？
6. 蛋白互作网络的用途和局限性是什么？
7. 蛋白是唯一的决定性因素吗？是的，绝大多数DNA和RNA层面的变化都会最终改变蛋白的功能。比如HSCR的无法形成ENS就是一个复杂的表型，可以肯定的是某些蛋白的功能执行紊乱了。
8. 基因表达的高低重要，还是基因表达的on/off重要？
9. 基因是如何找到和定位的？基因的编码的蛋白是如何确定的？
10. 如何理解基因之间的关系，是什么性质的关系？
11. 如何立即基因的拷贝数对基因表达的影响？
12. transposable-element对基因表达的影响？
13. 基因的经典结构是什么样的？什么是CDS和UTR？可以结合目前主流的基因预测工具来看。
14. 转录调控和蛋白互作有什么联系和区别？
Typical structure of a mature eukaryotic mRNA (AUG, UAA/UAG/UGA)
待续~
