GEO单细胞数据建立Seurat对象全过程与错误修复示例

进行单细胞转录组分析，有时候用到公共数据集，尤其是从GEO下载的10X数据，很多研究者常常会遇到一个令人头疼的问题——数据明明能读入，却无法正常创建Seurat对象。本文通过一个真实案例，带大家一起排查并解决这一问题。

这次遇到的问题发生在对数据集“GSM533785HC2”进行分析时。和往常一样，首先加载Seurat包，然后使用CreateSeuratObject()函数创建Seurat对象：

library(Seurat)
SeuratObject =  CreateSeuratObject(counts = Read10X('GSM533785HC2',gene.column = 2),
                     project = 'GSM533785HC2', min.cells = 3,
                     min.features = 200)

结果报错Error: No feature overlap between existing object and new layer data.

但是有运行的一些信息

10X data contains more than one type and is being returned as a list containing matrices of each type.Warning: Feature names cannot have underscores ('_'), replacing with dashes ('-')

说明数据已经能读取，但是并不能建立seruat对象，查看matrix矩阵信息与features信息、barcodes细胞数据是否一致，细胞数量，基因数量都对应上了，matrix第一列基因，第二列细胞，也都对应上了，到底哪里出了问题？

经过查看features文件，在文件末尾发现基因类型不一样，正常情况下都是Gene Expression，多出了Antibody Capture.

既然前面发现了数据能读取，那么先使用Read10X读取文件。

查看一下counts，发现counts是一个list，并不是创建seurat对象的矩阵文件，当中有Gene Expression和Antibody Capture两个矩阵，问题就是这里了。

那么接下来从counts中提取Gene Expression矩阵进行创建即可

SeuratObject =  CreateSeuratObject(counts = counts$`Gene Expression`,
                                   project = 'GSM533785HC2', min.cells = 3,
                                   min.features = 200)

运行结果没问题，并且能正常的NormalizeData。

从这个案例可以看出，Seurat读取10X数据时会自动识别不同类型的数据层，如果数据中既包含RNA表达量，又包含抗体捕获信号或其他组学类型，就会返回一个list结构而不是单一矩阵。若不加注意直接传入CreateSeuratObject，就会触发“feature不匹配”的报错。

因此，在处理公共数据或多模态数据时，建议在创建对象之前，始终先用str()或names()查看Read10X()的返回结构，明确其中包含哪些数据类型，再提取合适的那一部分用于构建Seurat对象。 

下载GEO或ArrayExpress中的单细胞数据时都会遇到类似困扰。错误信息中的“feature overlap”通常意味着输入数据结构与Seurat期望的矩阵格式不符，当Read10X()输出为list时，一定要注意手动提取Gene Expression矩阵。