转录组分析（二）：差异表达分析、功能分析、表达验证

一、差异表达分析：找关键样本和关键基因

1. 差异表达分析

哪些基因在两组样本中有明显表达差异？【获得基因集合】

（1）差异表达基因筛选

FC：fold change，>1上调，<1下调
log2FC：>0上调，<0下调

差异表达基因组内差异小，组间差异大

筛选条件：

• Padj＜0.05
• |log2FC|>1
• 不同软件结果不同。DESeq、edgeR
• 不用关注前人已研究清楚的基因
• 一般筛选出200~1500个差异基因

（2）可视化：火山图、热图

2. PCA（后续补充）

3. 聚类

基因集分析：找出几个重点想研究的关键基因【获得几个基因】

• 基因间聚类分析：表达模式相似的基因
• 相关分析：表达模式相似的基因
• WGCNA：找出关键基因

（1）聚类分析：聚类有多种算法，有的基于相关系数

• 样本聚类：探索样本之间的关系，锁定关键样本，分析关键样本间的差异表达基因
• 基因间聚类：相似表达模式基因

（2）相关分析

相关系数的三种计算方法：Pearson 相关系数、Spearman 相关系数、Kendel 相关系数

样本间相关系数：用来描述样本表达模式的相似程度

基因间相关系数：找到与已知基因关联的基因。甲壳素别人研究过了，相关分析找到另一个没研究的。基因表达模式相关可能预示基因功能上相关【不一定】

（3）WGCNA：探索基因与表型的关系

A：聚类将表达模式相似的基因划分为模块
B：各个模块与表型相关分析
C：用最相关的模块构建网络。处于网络中心位置与其他基因连接多的基因重要，边缘不重要

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二、功能分析

1. 富集分析

差异基因是否显著集中在某个功能分类上？（差异表达基因较多时）

GO分析：

pathway分析：

是否显著富集？看背景。1000个差异表达基因↓，总基因30000

分析软件

• 模式物种：GO、DAVID
• 非模式物种：ClusterProfiler

分析结果：

• 条形图。x-基因数，y-功能分类，颜色-p值
• 点图。x-比率，大小-基因数

2. 蛋白互作网络分析（PPI）：500个以内以内，基因数太多要分成子网络分析

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三、功能验证

1.实验验证

• 敲减
• 过表达

2.信息验证：生存分析

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四、分子机制

TCGA等联合分析：

• 序列变异
• 表观遗传
• 转录调控