二代数据组装叶绿体基因组
与核基因组相比，细胞器基因组相对来说，更为保守，并且序列较短，更加易于组装，仅仅根据二代测序reads即可进行组装。
下面简单介绍我在本项目中的方法，仅供参考。
1 数据
本次我使用的二代数据为50X。下机后，首先通过fastq对其进行过滤，改软件操作较为简单，仅仅使用-q 20进行过滤，得到clean reads、
2 叶绿体参考基因组
因为叶绿体基因组非常的保守，因此，我选择同科植物的叶绿体基因组。据文献记载，因为叶绿体为环状，因此将其叶绿体复制同样的拷贝串联在其对应的序列后面，防止有reads没有比对到环的连接出。将其合并后，作为一个总的叶绿体ref，chloropast.fa
3 筛选出叶绿体的reads
因为二代测序提取的DNA，除了主要的核DNA外，还有叶绿体，线粒体DNA等，因此首先需要将属于叶绿体的信息调取出来。即将reads比对到叶绿体ref。
## 我选择bowtie2
bowtie2-build chloropast.fa chloropast.fa
bowtie2 -q -x chloropast.fa -1 short_reads1 -2 short_reads2 -p 10 -S short.sam
samtools view -bS -o short.bam short.sam
samtools sort -@ 5 -o short.sorted.bam short.bam
samtools index short.sorted.bam
## 筛选比对上的成对儿reads即为叶绿体相关的reads
samtools view -u -f 1 -F 12 short.sorted.bam -o short.sorted.aligned.bam
samtools sort -n -o short.sorted.aligned.sorted.bam short.sorted.aligned.bam
## 将bam-2-fastq
bedtools bamtofastq -i short.sorted.aligned.sorted.bam -fq short.sorted.aligned.sortedR1.fastq -fq2 short.sorted.aligned.sortedR2.fastq
4 组装
本次选用unicycler 进行二代reads的组装，组装软件有很多，比如SoAPdenovo, ABySS, SPAdes, NOVOPlasty等，可以进行不同的尝试。
unicycler -1 $short_readsR1_aligned -2 $short_readsR2_aligned -t 10 -o Cp.fa
该软件可自己进行polish，如果用起他的软件进行组装，可以使用plion进行polish即可
unicycler的安装可以使用condan即可
conda create -n chloroplast -c uioconda unicycler python=3.6
5 组装结果
输出文件assembly.fasta为最终的组装结果，可将其和对应物种（最近的物种）的叶绿体基因组进行比较，确定其顺序，并进行连接。本次我组装的结果较好，并不存在gap，与已知的叶绿体基因组比较具有非常好的共线性。
后续说明
如果没有一个较为好的叶绿体基因组，必须通过比对的方式根据overlap对其进行连接。此外，如果存在gap，则必须对其进行补gap
- 可以通过GapCloser进行填补gap
- 多种软件的组装，进行填补gap
使用pilon的方法即将二代reads比对到组装好的结果，得到bam文件，进行polish
pilon --genome assembly.fasta --frags bwa.sort.bam --output F.pilon1 --changes --threads 4
如果组装质量较好，下面就可以对其进行注释。。后续在进行
欢迎扫码交流
