小编又回来了，上篇最后我们留下了以下两个问题，请大家思考是否正确: (没读过上篇"做成像的你不能不了解的真相3—信噪比1”的，一定要先读喔)。
1. 成像的追求，就是要不断提高信噪比；没有最好，只有更好
2. 图像的信噪比，一般肉眼判断一下就可以了, 定量计算很难，也没有必要
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首先看看第一个说法，从理论上说当然信噪比是越高越好。但是无限制的追求信噪比提升，是乌托邦理想主义（站着说话不腰疼）的想法，因为提高信噪比，是有代价的！
在样品和设备都不变的话，基本的提高信噪比的方法，阅读过前文的小伙伴应该知道答案了：
1. 提高激发光强度
2. 增加曝光时间
这两个方法都有负面作用——光漂白、光毒性或成像速度被限值。
现在回到现实中来，每一个实验根据实验目的的不同，其实对信噪比都有一个要求。只要满足了这个要求，进一步提高的意义不大。比如要测量一个人的体重，精确到0.1公斤就够了，精确到1克那就太过分了。
那我们来看看常见的实验目的，对信噪比的要求吧。(注: 经验值，供参考。)
· 需要判断是否检测到信号——仅需要观测到信号，信噪比要求>3:1
· 需要进行分类分析——软件能够把信号从背景中提取出来，信噪比要求>5:1
· 需要分辨结构——清晰的分辨出细节而不受噪声的影响，信噪比要求>15:1
· 需要定量测量——能够定量分析强度，信噪比要求>20:1
看图更直观，从低信噪比至高信噪比
SNR = 2：这个图看看就好，然后删掉吧
SNR = 5：可以确定检测到了信号，但是软件无法准确地将信号从背景中提取出来
SNR = 10：这个图像已经不错了，但是一些结构还无法清楚的分辨
SNR = 15：对多数应用，这个信噪比足够了，可以清晰的看到并用软件提取图像的细节
要点来了，小本本拿出来！信噪比对我们能否分辨结构细节也是有影响的！
我们接着来聊聊第二个问题。通过肉眼能否准确地估计出图像的信噪比呢？上图上图，看图说话不腰疼~
第一组，判断一下哪张图像信噪比更好：
第二组，判断一下图像左右两边哪边更亮：
专业答案分割线 （又来了。。。）-----------------------------------------------
先来说第一组图像，觉得右边图像信噪比高的同学请举手！！
我们来看看有多少人回答错误！哈哈哈哈
正确答案是两边信噪比是一样的。因为这两张图实际上是同一张。为什么两张图像看起来差别挺大呢？答案就是对比度，请参考“做成像的你不得不了解的真相1-对比度”
可以看出，仅仅通过调节显示范围，就可以使图像呈现不同的视觉效果，给人信噪比差别很大的错觉。（小编在用Fiji=ImageJ，免费哦！功能很强大哦！）
接下来是第二个图像，连续被小编问题坑的小伙伴是不是有点忐忑。
话不多说，定量分析一下。 红色曲线显示水平线上的亮度变化（Fiji：Line Profile）。
噫噫噫，两边怎么是一样的 ？！！发生了什么？
实际上每个方块里的亮度是渐变的，不过人眼无法有效的辨识这种亮度的渐变。但是交界处就不同啦，我们视觉发现了反差，又回到了对比度的问题！
关于信噪比的讨论
以上的例子可以看出，大家拍图时，虽然经常通过目测判断图像信噪比是否满足要求，但是在关键时候定量分析还是非常必要的。总结一下，可能下面这两个原因是最重要的，小伙伴们考虑一下是否与你相关：
· 用来决定样品和实验条件的设置依据
要知道我们成像的时候，大部分情况都受制于图像中的散粒噪声
虽然不断努力提升信号强度仍然可以逐步提高信噪比，但是开个平方根后怎么都有点吃力不讨好。
实际成像中信噪比刚好能满足实验需求最好！如果能够快捷地计算信噪比，就可以指导我们选择最合适的曝光时间和激发光强度，从而达到保护样品或提高速度的目的。要知道实验做到一半细胞 “见光死”可是非常郁闷的！
· 判断测量误差或是数据分析要求
举个简单的例子，假设样品里有两类细胞，理论上其中一类细胞里被标定的蛋白表达要高于另一类，我现在需要拍照定量测量来判断一下。
两位同学来帮忙了，左边是同学A拍到的图像后强度的分析，右边是同学B，柱状图是两种细胞的平均强度，红线代表了标准偏差（噪声）。小伙伴来判断一下能否从图像中得到我期望的结果。
可能很多小伙伴觉得两位同学得到的结果都符合实验预期，但是实际上这两个结果有本质上的区别。同学B的结果虽然勉强可以说还是能够把强度区分开来，但是结果的可信度并不高。
任何定量测量都有个置信区间（confidence intervals)这样一个统计概念。例如信噪比等于10：1的话，我们需要20%的强度变化，才能有95%的信心说这是两个不同强度的信号。
而信噪比降低到5：1时，这个值是就变成了40%！看看，信噪比低的时候，我们对测量的信心也疯狂降低啊。这里就不细说了，有兴趣的小伙伴可以自己找资料学习一下（注：统计学可是噩梦啊！）。
生物研究不容易，一个实验要准备多少样品，分析多少图像啊！如果不定量凭感觉，我们怎么知道采集的图像、数据、结果能否说明问题，发论文前补数据可不是个令人愉悦的事情。
关于信噪比的有趣事实
最后，小编总结的一些关于信噪比的有趣事实:
· 适合分析的图像都是散粒噪声限制的图像；
上面提过图像要适合分析，信噪比要求要大于10：1（之前说的是15：1, 我们打点折扣方便计算）。信噪比大于10:1的图像，信号要大于100个电子，记得吗
100e-信号的散粒噪声是10e-，拿现在最新的科学级CMOS相机为例，相机的读出噪声通常是1-1.5e-左右，远小于散粒噪声。
关于信号强弱还有个误区，很多小伙伴在做单分子荧光成像。大家一提单分子就觉得信号很弱，其实不然。以现在很流行的单分子荧光定位超高分辨率（STORM，PALM）图像分析为例，多数分析软件都会滤掉信噪比不够的点（这些点的定位精度差, 影响分辨率）。其实就是去掉一定域值下的弱信号（通常大于50e-）。
等一下，怎么好像在说适合分析的图像的信噪比只和信号有关，我花钱买那么贵的相机意义何在？
· 相机的 QE和读出噪声决定了相机从读出噪声限制区域到散粒噪声限制区域过度的早晚；
如果只是看到前一条，正在庆幸自己实验室那套老设备也能做高大上实验的时候，这可能是个小打击。
举个例子，假如我们有三台相机，我们可以通过测算它们在不同信号强度下的信噪比来比较他们的性能。见上图（横坐标代表信号强度，纵坐标是信噪比，注意：这里是对数坐标轴）。首先有一台100%量子效率，并没有任何噪声的理想相机（灰色曲线）。第二台量子效率47.5%，读出噪声6e-（蓝色曲线）。第三台量子效率95%，读出噪声1.5e-（黄色曲线）
对比三条曲线，有两个要点要给小伙伴说说：
第一逐步提升信号强度，两条曲线都在向理想相机的平行线靠拢，但永远无法达到理想相机的水品，原因就是量子效率无法达到100%，但高量子效率的相机更趋近于理想相机。
第二，如果逐步减少信号强度，蓝色曲线更早的开始偏离理想相机的平行线，而黄色曲线在信号即便很弱的情况下也与理想相机更相似，原因在于量子效率95%的这台相机同时其读出噪声更小（1.5e-）。
对比之后，这台量子效率只有47.5%的相机可能需要至少2倍以上，弱光下甚至近8倍的信号（曝光时间）才能达到量子效率95%相机的信噪比。
大家不要震惊哦！实际上即便是科研相机也有着巨大的性能差距。
· 图像信噪比和信号的电子数相关。注意，我说的是电子数，不是灰度值！
等等等等，怎么又有新概念啊！电子数，灰度值是什么？没讲过啊，又夹带新概念啊！呵呵，这是我们下一篇要讲的内容。有人告诉小编，不要一次讲完，比较容易吸粉。
以上，小编花了好多力气，希望能说服大家认可在日常的工作中要关注和深入理解图像的信噪比。其实有读者留言说了，你还是讲的不够清楚，具体怎么定量计算信噪比，一步一步解释一下啊。这个，小编也准备了，要下下回分解。
