转载：诺娃讲堂 | 基因组学策略（二）揭开组装的神秘面纱上篇（基因拼接算法）

转载：http://mp.weixin.qq.com/s?src=3&timestamp=1497750890&ver=1&signature=mpi1HsAEwSjleL*3kwkDHDi-56Y1sbeBTxp4pgBbSFYZySCOWxzJvtXJ0fJlxVzGEy-HooEToC8oaHuSgcxUL7a4uYHol9y6E6w-qjwtU03qJxprX*dZjIumA0A2hGNSgv2RO1eGZo7IIWjPEzxP6Q==

 

如果把基因组研究当作建造一栋高楼大厦，测序数据就可以看成建楼的砖，而组装则好比是搭建这栋建筑的整体架构的过程。通过基因组学策略（一）介绍的测序平台得到数据后，如何开展基因组从头组装呢？我们从算法谈起。

测序平台不断更新升级，基因组组装所用的算法也不尽相同，目前广泛使用的有两种算法：OLC算法（Overlap-Layout-Consensus）和DBG算法（De-Bruijn-Graph）

OLC算法

主要分为三步：（1）Overlap：找到片段间的重叠信息；（2）Layout：根据得到的重叠信息将存在的重叠片段建立一种组合关系，形成重叠群，即Contig；（3）根据构成Contig的片段的原始质量数据，在重叠群中寻找一条质量最重的序列路径，并获得与路径对应的序列，即Consensus。

OLC算法最初成功的用于Sange测序数据的组装，比如Celera Assembler，Phrap，Newbler等均采用该算法进行拼接组装。

DBG算法

首先将reads打断成长度为K的核酸片段，即Kmer，在利用Kmer间的overlap关系构建DBG，再通过DBG得到基因组序列。

DBG算法最早应用于如细菌类小的基因组的组装上，直到李瑞强等(2010)开发SOAPdenovo 算法，成功的组装了采用二代测序的黄瓜及熊猫的基因组，DBG算法开始普遍运用。

图1 OLC算法示意图（a）和DBG算法示意图（b）

假设我们获得的reads是20bp，图1a中，生成6个片段，每个片段长度（L）是10bp，至少重叠长度（O）为5bp，然后各个片段建立OLC图。图1b的Kmer为5，建立DBG图。

DBG算法相比于OLC的优势是什么？

由于二代测序得到的reads长度较短，包含的信息量较少，因此完成基因组拼接需要较高的覆盖度。OLC算法适用于读长较长的序列组装，通过构成的OLC图寻找Consensus sequence的过程，实际上是哈密顿通路寻找的问题，算法非常复杂。

若采用OLC算法，会大大增加拼接的复杂性以及运算量。而采用DBG算法，通过K-1的overlap关系，构建DBG图，通过寻找欧拉路径得到Contig序列，从算法的角度极大的简化了组装的难度。

讲完算法，我们以目前应用广泛的 SOAPdenovo 软件为例来介绍组装过程。

SOAPdenovo软件的组装过程

（1）通过Kmer之间K-1的overlap关系构建contig（重叠群），如图2：

图2 contig示意图

（2）利用pair-end信息，将无overlap关系的contigs搭建成scaffold(脚手架），如图3：

图3 scaffold示意图

1数据纠错

要得到一个有较高准确性的基因组图谱，首先对测序得到的数据进行处理：
将reads逐bp打断成长度为K的连续核酸序列，如上图a所示，若这条reads中间由于测序错误有一个错误的碱基，那么在得到的Kmer中，也会有一些错误Kmer或者低频Kmer。

绘制Kmer频数分布图时，如上图b所示，Error free代表没有测序错误的Kmer频数分布，Error rate1%代表有1%错误率的Kmer频数分布。

错误Kmer对后续组装会产生很大的困扰，因此，在构建DBG图之前，需要先对数据进行纠错。纠错的两种方法：

（1）基于Read间的比对，通过多序列比对，通过概率模型区分测序错误引起的错误Kmer。这种方法纠错准确，但需要消耗较大的计算资源。如ALLPATH-LG，ECHO等纠错软件都基于这种方法。

（2）通过Kmer频数图谱进行区分，这类软件如SOAPdenovo，Euler等。

2构建Contig

根据Kmer之间的overlap关系进行连接，如下图所示：
reads（read1：AGATCTTGTTATT；read2：GTTATTGATCTCC）逐bp的打断成长度为5bp的Kmer，根据Kmer间的overlap关系进行连接。可以看到两条reads中 GATCT 和 GTTATT 是两个重复的片段，在构建De Bruijn图中，会形成如上图的泡状结构以及多个分支的情况，面对这种很复杂的图，如何才能找到那一条正确的路径呢？

（1）对De Bruijn图进行化简

简化De Bruijn图需要去掉无法继续连接的分支、低覆盖度的分支，并且利用序列信息化简重复序列在De Bruijn图的分叉通路，对于少量的杂合位点，采用随机选择策略，合并杂合位点。通常需要考虑如下几种情况：

A.由于测序错误形成的低频Kmer，直接删除；

B.通过短序列将一些很短的重复解开；

C.如果Kmer1和Kmer2有很高的相似性，将形成的泡状结构合并；

（2）得到一个简化的De Bruijn图后，仍然会因有很多分叉位点无法确定真正的连接关系，因此接下来在每个分叉位点将序列截断，得到了最初contigs。

留给大家一个思考题：根据上述步骤，我们看下图4中复杂的De Bruijn示意图，可以得到什么样的contigs呢？（答案见文末）

3构建scaffold

将测序得到的reads比对回得到的contigs，利用reads之间的连接关系和插入片段大小信息，将contigs组装成scaffolds。

4补洞

得到的scaffold中间会有较多的gap，为了使组装的序列更完整，需再次利用测序的双末端数据之间的配对关系连接contigs，并利用测序数据与已经组装的contig之间的覆盖关系对contig之间空隙进行补洞，延长contigs，补洞后的contigs长度相比补洞之前一般增加2-7倍。

以上就是SOAPdenovo组装的基本过程，看明白了吗？

“揭开组装的神秘面纱下篇”敬请期待～

参考文献

1. Li RQ, Zhu HM, Ruan J, et al. Denovo assembly of human genomes with massively parallel short readsequencing. Genome Res. 2010, 20(2), 265-72.

2. Li ZY, Chen YX, Mu DS, et al. Comparison of the two majorclasses of assembly algorithms: overlap-layout-consensus andde-bruijn-graph. Brief Funct Genomics. 2012, 11(1), 25-37

思考题参考答案