从结构到功能：ACKR3 纳米抗体为 GPCR 靶向药物开辟新路径

       G 蛋白偶联受体（GPCR）是人体内最重要的药物靶点家族之一，可介导细胞感知各类胞外信号并启动下游级联应答，在免疫调节、神经传导、细胞迁移、炎症及肿瘤进展中发挥核心调控作用。但 GPCR 属于七次跨膜膜蛋白，胞外表位狭小、构象动态多变，传统小分子药物、多肽以及全长单克隆抗体在靶点选择性、结合效率、特异性识别等方面均存在明显局限，极大制约了靶向药物的研发进程。纳米抗体（VHH，单域重链抗体）凭借分子量小、组织穿透性强、表位识别模式灵活等独特优势，逐渐成为 GPCR 靶向药物研发极具潜力的技术方向。但现阶段对于纳米抗体与 GPCR 之间相互作用的结构特征、选择性识别机制、受体功能拮抗的分子基础尚不清晰，限制了靶向 GPCR 纳米抗体的理性设计与临床转化。Schlimgen 团队以靶向非典型趋化因子受体 ACKR3 的拮抗型纳米抗体 VUN701 为研究模型，系统解析了 GPCR - 纳米抗体的结合模式、选择性来源以及受体失活的构象调控机制，为 A 类 GPCR 靶向纳米抗体的分子设计、拮抗类生物药开发提供了关键结构理论依据。

一、GPCR 靶向药物研发困境与纳米抗体技术优势

       人类基因组编码超过 800 种 GPCR，是现阶段获批药物最主要的作用靶点家族，然而目前仅有约 1/8 的 GPCR 拥有成熟上市的靶向药物，绝大多数受体仍缺乏可高效靶向干预的候选分子。当前临床主流靶向策略以小分子化合物与多肽药物为主，虽具备细胞膜穿透性强、给药便捷等优势，但普遍存在靶点脱靶、亚型选择性差、易产生耐药等缺陷。全长单克隆抗体凭借特异性高、半衰期长的优势在生物药领域广泛应用，近年来已有两款 GPCR 靶向单抗获批上市，分别为靶向 CGRP 受体的厄瑞努单抗、靶向 CCR4 的莫格利组单抗。但全长 IgG 分子抗原结合面较大，难以精准识别 GPCR 狭小的胞外构象表位，大规模筛选数据显示，现有抗 GPCR 抗体中仅 61% 具备特异性靶向活性，极大提升了 GPCR 生物药的研发成本与筛选难度。

        纳米抗体源自骆驼科动物重链仅抗体，仅保留单个重链可变结构域，分子量仅 12~15 kDa，可深入识别全长抗体难以触及的狭窄、凹陷型膜蛋白表位，完美适配 GPCR 胞外区的结构特征。2019 年全球首款纳米抗体药物卡普拉珠单抗获批，标志着纳米抗体正式进入商业化临床应用阶段；当前靶向 CXCR4、CX3CR1 等趋化因子类 GPCR 的多款纳米抗体已进入临床研究阶段，展现出广阔的应用前景。充分阐明纳米抗体与 GPCR 的结合模式、选择性识别结构基础以及功能调控机制，能够极大推动靶向 GPCR 纳米抗体从工具分子向治疗药物的转化。

二、靶向 ACKR3 拮抗型纳米抗体 VUN701 的功能学表征

        本研究选取非典型趋化因子受体 ACKR3 作为靶点，通过生物发光共振能量转移（BRET）技术构建 GPCR 功能筛选体系，系统表征纳米抗体 VUN701 的靶向特异性与拮抗活性。ACKR3 主要通过结合趋化因子 CXCL11、CXCL12，招募 β-arrestin2 介导下游信号活化，参与免疫细胞趋化、肿瘤转移、血管重塑等病理过程。细胞水平功能实验结果显示，VUN701 可显著抑制 CXCL11、CXCL12 依赖的 β-arrestin2 向 ACKR3 募集，半数抑制浓度 IC₅₀分别为 105 nM、157 nM。

        针对 CXCL12 介导的受体激活开展 Schild 剂量效应分析发现，VUN701 可浓度依赖性降低趋化因子的激动效价，但不改变量效曲线最大效应与曲线斜率，证实该纳米抗体属于可逆性竞争性拮抗剂。同源性最高的趋化因子受体 CXCR4、CXCR3 分别作为 CXCL12、CXCL11 的天然受体，在最高 10 μM 给药浓度下，VUN701 无法抑制两种同源受体介导的 β-arrestin2 信号活化，充分证明该纳米抗体对 ACKR3 具备高度靶点选择性。

三、VUN701 发挥靶向选择性与拮抗功能的结构基础

（一）延伸型 CDR3 环是 GPCR 靶向纳米抗体的核心结合基序 

       通过解析 VUN701 溶液三维结构发现，该纳米抗体拥有一段延伸型 CDR3 互补决定区环结构，该结构在常规可溶性抗原靶向纳米抗体中较为罕见，却是靶向 GPCR 的纳米抗体普遍存在的特征基序。CDR1、CDR2 结构突变后的 VUN701 仍可保留对 ACKR3 的结合能力与拮抗活性；而 CDR3 区域突变会直接导致纳米抗体几乎完全丧失受体结合功能与信号抑制活性，证明延伸型 CDR3 是 VUN701 识别 ACKR3 胞外表位、实现高亲和力结合的核心结构元件。

        延伸型 CDR3 可嵌入 GPCR 胞外区的凹陷表位，精准识别 ACKR3 区别于 CXCR4、CXCR3 等同源受体的独特构象特征，从分子层面赋予 VUN701 优异的靶点亚型选择性，有效规避同源 GPCR 脱靶带来的副作用。

（二）竞争性占据配体结合表位实现受体拮抗失活

       通过分子对接、界面残基定点突变等手段精准绘制 VUN701 与 ACKR3 的相互作用界面，证实该纳米抗体结合位点与趋化因子 CXCL11、CXCL12 在受体上的结合区域高度重叠。VUN701 通过延伸 CDR3 锚定在 ACKR3 胞外配体结合口袋，以空间位阻的方式竞争性阻断趋化因子与受体的相互作用，阻止受体发生构象活化，抑制 β-arrestin2 招募及下游信号通路传导，最终实现 GPCR 竞争性拮抗效应。

        同时，纳米抗体的结合可将 ACKR3 稳定锁定在非活性构象，从结构层面避免受体自发激活，进一步强化拮抗作用，为 A 类 GPCR 失活型靶向分子的理性设计提供了全新结构模板。

四、研究意义与药物研发应用价值

       本研究首次从结构层面阐明了靶向 GPCR 纳米抗体的选择性来源与竞争性拮抗机制，证实延伸型 CDR3 是靶向七次跨膜受体纳米抗体的标志性功能基序，解释了纳米抗体相较于全长单抗更适配 GPCR 狭小胞外表位的结构本质。基于 ACKR3-VUN701 的相互作用模型，可通过 CDR3 区域的序列改造、长度优化、氨基酸定点突变实现靶向 GPCR 纳米抗体的亲和力提升、亚型选择性定向改造，大幅降低 GPCR 拮抗类生物药的筛选周期与研发成本。

       该研究不仅为趋化因子受体家族靶向纳米抗体药物开发提供了设计策略，也为自身免疫病、肿瘤、炎症相关 GPCR 靶点的工具分子开发、治疗性中和纳米抗体设计奠定了结构理论基础，推动纳米抗体成为攻克 GPCR 靶向选择性难题的新一代生物医药研发工具。

五、总结

       GPCR 结构的复杂性与胞外表位的局限性长期制约着靶向生物药的发展，纳米抗体凭借独特的单域结构成为解决该瓶颈的重要方向。以 ACKR3 靶向纳米抗体 VUN701 为模型的结构与功能研究证实，延伸型 CDR3 环是 GPCR 靶向纳米抗体实现高特异性识别的核心结构基础；该纳米抗体通过竞争性占据趋化因子结合口袋，稳定受体非活化构象，可逆性阻断 CXCL11、CXCL12 介导的下游信号传导，是典型的选择性竞争性 GPCR 拮抗剂。该研究解析了纳米抗体靶向 GPCR 的作用模式与拮抗分子机制，建立了基于 CDR3 结构改造的理性设计策略，为 A 类 GPCR 靶向纳米抗体、中和类治疗生物药的研发提供了重要的理论支撑与技术参考。