在适配体筛选、蛋白互作研究等生物医学领域，“如何在三维空间中稳定固定蛋白并保留其功能” 是关键技术瓶颈。大孔聚乙二醇（PEG）水凝胶凭借抗污染、高渗透性的优势，成为蛋白固定的理想载体 —— 本文将从化学机制、验证策略、功能应用三个维度，拆解大孔水凝胶蛋白固定技术的核心逻辑，及其在适配体筛选中的关键作用。
要实现蛋白在水凝胶三维网络中的稳定固定，需解决 “载体功能化” 与 “温和偶联” 两大问题，研究通过精准的化学设计给出方案：
- 水凝胶功能化修饰：在 PEG 水凝胶预制液中添加丙烯酸，利用自由基聚合反应，将羧基（-COOH）均匀引入水凝胶网络。这一步的关键是控制丙烯酸添加比例 —— 既要保证羧基密度足以结合蛋白，又要避免过量丙烯酸影响水凝胶的机械性能（如溶胀率、柔软度）。
- 碳二亚胺介导的偶联反应：采用标准碳二亚胺化学法激活羧基，其反应机制可分为两步：首先，碳二亚胺（如 EDC）与羧基反应生成高活性的 O - 酰基异脲中间体；随后，该中间体与蛋白分子中的氨基（-NH₂，如赖氨酸残基上的氨基）发生亲核取代反应，形成稳定的酰胺键（-CONH-），最终将蛋白 “锚定” 在水凝胶网络中。
- 偶联条件的优势：整个反应在常温、水溶液环境中进行，pH 控制在 6.0-7.0，完全模拟生理条件 —— 这避免了高温、有机溶剂对蛋白构象的破坏，能最大程度保留蛋白的生物活性（如酶活性、配体结合能力），为后续功能实验奠定基础。
仅通过化学反应设计无法完全确认蛋白固定效果，研究通过 “实验验证 + 对照排除” 的组合策略，从多个维度证实固定可靠性：
- 荧光成像的直观证据：选择荧光素标记的白蛋白作为模型蛋白，偶联反应后，用缓冲液反复洗涤水凝胶以去除游离蛋白，再通过 Maestro 成像系统观察。结果显示，水凝胶内部呈现均匀的荧光信号，清晰证明白蛋白已进入水凝胶网络并实现固定；若未洗涤干净，仅水凝胶表面会出现荧光，这一步排除了 “游离蛋白残留” 的干扰。
- 空白对照的必要性：设置 “不含羧基的 PEG 水凝胶” 作为空白对照，在相同实验条件下，空白水凝胶几乎无荧光信号。这一结果至关重要 —— 它证实蛋白的固定依赖于羧基与氨基的特异性酰胺键结合，而非蛋白在水凝胶表面的非特异性吸附（如疏水作用、静电作用），排除了假阳性干扰。
- 红外光谱的结构佐证：通过红外光谱进一步验证，固定蛋白的水凝胶在 1650 cm⁻¹ 处出现酰胺 Ⅰ 带（蛋白肽键的 C=O 伸缩振动），1540 cm⁻¹ 处出现酰胺 Ⅱ 带（N-H 弯曲振动与 C-N 伸缩振动），而空白水凝胶无这两个特征峰。从化学结构层面证实，蛋白确实通过共价键偶联至水凝胶，而非物理包裹。
蛋白固定的最终目的是实现功能应用，研究以凝血酶（适配体筛选的经典靶标）为对象，验证固定化蛋白对适配体的 “选择性滞留” 效应，核心实验设计与结论如下：
- 实验体系搭建：将凝血酶固定于大孔 PEG 水凝胶，随后加入已知高亲和力凝血酶适配体 60-18 (29)（该适配体经 11 轮传统筛选获得，Kd=0.5 nM ），同时加入低亲和力适配体作为对照。
- 滞留率的量化差异：通过检测水凝胶释放液中适配体的浓度，计算 24 小时滞留率 —— 高亲和力适配体 60-18 (29) 的滞留率达 27%，而低亲和力适配体仅为 9%。这一差异的本质是 “结合亲和力调控扩散行为”：高亲和力适配体与固定化凝血酶频繁结合，游离态浓度低，扩散出凝胶的速度慢；低亲和力适配体则以游离态为主，快速扩散释放。
- 成像与数据的一致性：水凝胶荧光成像结果与释放液检测数据完全匹配—— 高亲和力适配体组水凝胶内部荧光强，低亲和力组荧光弱。这进一步证实，滞留率差异是真实的 “功能筛选效应”，而非实验操作误差。
- 与模型分析的呼应：该实验结果与前期扩散 - 结合模型预测趋势一致，说明 “基于亲和力的滞留效应” 具有理论支撑，可作为后续适配体一步筛选技术（如 HAS 方法）的核心原理。
大孔水凝胶的蛋白固定技术，之所以能成为适配体筛选的关键支撑，核心在于它解决了传统筛选的两大痛点：
- “清洁” 的筛选环境：PEG 水凝胶本身抗污染，无蛋白非特异性吸附，结合特异性偶联的固定化蛋白，形成 “靶标明确、背景干净” 的筛选体系，无需传统筛选中的阴性筛选步骤；
- 三维空间的模拟优势：大孔结构（平均孔径 50μm）模拟体内组织微环境，适配体可自由扩散，与固定化蛋白的结合更接近生理状态，筛选出的适配体更具体内应用潜力。
从化学修饰到功能验证，大孔水凝胶的蛋白固定技术展现出 “高特异性、高稳定性、高功能性” 的优势 —— 它不仅是蛋白固定的有效手段，更为适配体筛选、蛋白互作研究等领域提供了全新的技术平台，推动相关研究从 “体外简单体系” 向 “生理模拟体系” 升级。
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