在创新药物研发领域，环肽因兼具 “高靶标亲和力、良好生物稳定性、低脱靶风险” 的特性，成为靶向蛋白药物的重要候选分子。而 DNA 编码库（DNA-encoded Libraries, DELs）作为高通量筛选技术的核心代表，凭借 “将化合物分子与独特 DNA 标签关联，实现亿级分子库的高效筛选” 的优势，已成为环肽活性分子发现的关键工具。近年来，科研界围绕 “开发 DEL 兼容的大环化方法” 投入大量精力 —— 毕竟环肽的环合效率、连接子结构直接影响库的多样性与活性分子的筛选效率。近期一项研究聚焦 “不同环连接子对 DEL 筛选结果的影响”，通过构建 8 个差异化子库、针对 MDM2 和 GIT1 两个蛋白靶点开展筛选，揭示了两种截然不同的筛选规律，为 DEL-based 环肽库设计与活性分子验证提供了重要参考。
环肽相较于线性肽，因环结构限制了构象灵活性，能更精准地契合靶蛋白结合口袋，大幅提升结合亲和力与体内稳定性，是针对 “难成药” 靶点（如蛋白 - 蛋白相互作用靶点）的理想分子类型。但环肽的筛选面临一大挑战：传统高通量筛选方法难以覆盖足够的环肽结构多样性，而 DEL 技术虽能实现海量分子的并行筛选，却对 “大环化反应” 有严格要求 —— 环合反应需在 DEL 兼容的条件下（如温和缓冲液、避免破坏 DNA 标签）进行，且连接子的结构会直接影响环肽的构象、与靶标的结合模式。
因此，“明确不同环连接子如何影响 DEL 筛选效率与活性分子发现”，成为解决 “DEL - 环肽筛选” 瓶颈的关键问题。该研究团队正是基于这一需求，设计了 8 个含不同环连接子的 DEL 子库 —— 连接子的差异主要体现在 “链长、原子组成、刚性 / 柔性” 上，确保能覆盖多样化的环肽构象，进而对比其在不同靶点筛选中的表现。
研究团队选择 MDM2（p53 蛋白的负调控因子，在多种肿瘤中高表达，是抗癌药物关键靶点）和 GIT1（参与细胞迁移、信号通路调控，与神经退行性疾病、肿瘤转移相关）作为筛选靶标，通过将 8 个子库分别与两个靶点孵育、富集结合型 DNA 标签、高通量测序分析富集规律，得到了两种具有代表性的结果。
针对 MDM2 的筛选中，一个关键发现是 “多个子库的富集序列呈现明显的结构相似性”—— 尽管这些子库采用不同环连接子，但富集出的环肽分子在 “核心结合区域（与 MDM2 口袋互补的氨基酸序列）” 高度一致，仅环连接子部分存在差异。这种 “跨子库的结构趋同性” 大幅增强了 “筛选出的分子为真实活性分子” 的可信度 —— 毕竟若仅单一子库出现某序列富集，可能存在 “非特异性结合” 或 “实验误差”，而多子库共同指向相似结构，说明该类环肽的核心序列是与 MDM2 结合的关键，连接子更多是 “辅助维持构象” 而非 “决定结合特异性”。
后续的活性验证进一步证实了这一结论：从富集序列中挑选的代表性化合物 cmp-10，通过体外抑制实验检测显示出强效活性 —— 对 MDM2 的抑制常数（Ki）达 11 nM，这一数值达到了临床前候选分子的活性水平。更重要的是，cmp-10 的环连接子虽来自某一特定子库，但将其连接子替换为其他子库中的相似柔性连接子后，对 MDM2 的抑制活性无显著下降，再次证明 “MDM2 结合环肽的核心是氨基酸序列，连接子的柔性范围内差异不影响核心结合作用”。
与 MDM2 的 “跨子库结构相似性” 不同，针对 GIT1 的筛选呈现出 “离散富集模式”——8 个子库中，仅 3 个子库出现明显的序列富集，且不同子库的富集序列无显著结构相似性，甚至核心氨基酸序列也存在较大差异。这一结果提示：GIT1 的结合口袋对环肽的构象更为敏感，环连接子的结构直接决定了环肽能否 “适配口袋构象”—— 刚性连接子可能限制环肽的构象调整，仅特定链长的刚性连接子能让环肽形成与 GIT1 互补的构象；而柔性连接子虽能灵活调整构象，但也可能因 “构象过于松散” 导致结合亲和力下降，难以被有效富集。
为确保从离散富集序列中筛选出真实结合的分子，研究团队采用 “on-DNA+off-DNA 双模式验证” 策略：首先通过 “on-DNA 结合实验”（检测带 DNA 标签的环肽与 GIT1 的结合能力）初筛，再将候选分子脱离 DNA 标签（off-DNA），通过表面等离子体共振（SPR）检测其与 GIT1 的结合亲和力。最终筛选出的 cmp-17 表现出优异的特异性 ——SPR 结果显示其与 GIT1 的解离常数（Kd）为 1.22 μM，且通过分子对接验证，cmp-17 能精准嵌入 GIT1 的预设结合口袋，未与其他同源蛋白发生非特异性结合。
更深入的机制研究进一步揭示了 cmp-17 的作用价值：研究团队构建了 GIT1 的两个突变体（GIT1L271A/L279A、GIT1L271K/L279K），通过等温滴定量热法（ITC）检测 cmp-17 与突变体的结合能力 —— 结果显示，当 GIT1 结合口袋中的亮氨酸（L271、L279）被丙氨酸（A，小侧链）或赖氨酸（K，带正电）替换后，cmp-17 的结合亲和力显著下降，证明 cmp-17 是通过与 L271、L279 形成疏水相互作用，干扰 GIT1 与下游蛋白 β-PIX 的结合，进而阻断其介导的信号通路。这一机制解析为后续基于 cmp-17 的分子优化提供了明确方向。
该研究通过 “双靶点、多子库、系统验证” 的设计，为 DEL 技术在环肽发现中的应用提供了三大核心启示，对科研与药物研发具有重要参考价值：
不同靶蛋白对环肽构象的需求差异显著：MDM2 结合口袋对环肽构象的包容性较强，柔性连接子的差异不影响核心结合；而 GIT1 结合口袋对构象要求严苛，仅特定连接子能让环肽形成有效结合构象。这提示在设计 DEL 环肽库时，需先通过靶点结构分析（如基于晶体结构的口袋特性预测），初步判断 “适合的连接子类型”—— 对包容性强的靶点，可选择多样化连接子以提升库的多样性；对构象敏感的靶点，需优先选择与口袋互补的连接子，减少无效筛选。
针对 MDM2 的筛选结果表明，多子库共同富集 “核心序列相似的环肽”，是 “真实活性分子” 的重要标志 —— 这一规律可用于 DEL 筛选后的初筛阶段，快速排除 “仅单一子库富集、可能为非特异性结合” 的序列，减少后续验证的工作量，提升筛选效率。
GIT1 筛选中的 “离散富集” 提示，仅依赖 DEL 测序的富集结果可能遗漏真实活性分子，或误判非特异性结合序列。而 “on-DNA 验证（排除 DNA 标签干扰）→off-DNA 验证（模拟体内无 DNA 环境的结合能力）→突变体验证（明确结合位点与机制）” 的三步验证策略，能最大限度确保筛选出的分子是 “特异性结合靶标、且作用于预设结合口袋” 的活性分子，为后续的分子优化与成药性评估奠定可靠基础。
该研究不仅明确了 “环连接子对 DEL 筛选结果的影响规律”，更搭建了一套 “DEL 环肽库设计→靶点筛选→活性分子验证” 的完整研究框架。对于科研人员而言，这一框架可直接指导针对不同靶点的 DEL 环肽库构建；对于药物研发而言，DEL 技术与环肽的 “协同优化”，将大幅提升针对 “难成药” 靶点（如蛋白 - 蛋白相互作用、转录因子）的活性分子发现效率，为抗癌、神经退行性疾病等领域的创新药物研发开辟新路径。
未来，随着 DEL 兼容大环化方法的进一步丰富（如引入非天然氨基酸连接子、光控环合反应），以及 “AI 预测 - DEL 筛选 - 结构生物学验证” 的多技术融合，环肽活性分子的发现将进入 “精准化、高效化” 新阶段，为更多疾病患者带来新的治疗希望。
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