牛 CDR3 单抗的制备过程：从免疫到纯化的全流程解析

牛 CDR3 单抗因超长 CDR H3 的 “茎 - 旋钮” 结构具有特殊制备要求，其过程融合了传统单抗技术与针对超长 CDR 区的优化策略，具体可分为 6 个核心步骤：
一、免疫原设计与动物免疫
·免疫原制备：根据目标抗原（如病毒蛋白、细菌毒素）的特性设计免疫原，优先选择含隐蔽表位或保守区域的重组蛋白（如 HIV Env 的 V2-apex 区域、口蹄疫病毒 VP1 蛋白），以诱导牛产生针对特定表位的超长 CDR3 抗体。
·牛免疫方案：选用健康犊牛（6-12 月龄，免疫系统发育完善），采用 “基础免疫 + 加强免疫” 策略：首次免疫用弗氏完全佐剂乳化的抗原（1-2mg / 头），间隔 2-3 周用弗氏不完全佐剂加强免疫 3-4 次，每次免疫后 7 天检测血清效价（通过 ELISA 测定，效价≥1:10000 视为有效）。
·免疫优势：牛免疫系统对复杂抗原的应答具有天然优势，常规免疫即可诱导产生含超长 CDR3 的抗体，无需像人类 “精英患者” 那样依赖长期病毒选择。
二、B 淋巴细胞分离与抗体基因克隆
·B 细胞分选：免疫结束后 3-5 天，采集牛外周血或淋巴结，通过流式细胞术分选抗原特异性 B 细胞（标记抗原 - 荧光抗体复合物，筛选 CD19⁺IgG⁺细胞），或采用单细胞微流控技术捕获单个 B 细胞，提高基因克隆效率。
·抗体基因扩增：对分选的 B 细胞进行单细胞 RT-PCR，扩增重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因。针对牛 CDR3 的特殊性，需设计特异性引物（覆盖 IGHV1-7 和 IGH D8-2 基因重组区域），确保超长 CDR H3 序列（50-60 个氨基酸）被完整扩增。
·序列分析：通过基因测序筛选含超长 CDR H3（长度≥50aa）且富含半胱氨酸（4-12 个）的克隆，初步判断 “茎 - 旋钮” 结构的潜在形成能力（如含保守序列 T (T/S) VHQ 和 YxYxY）。
三、抗体文库构建与展示
·载体构建：将筛选出的 VH 和 VL 基因插入展示载体（常用噬菌体展示载体 pCANTAB5E 或酵母展示载体 pYD1），确保抗体片段（Fab 或 scFv）正确折叠并展示于载体表面。针对牛 CDR3 的二硫键密集特性，可在载体中引入氧化还原相关基因（如大肠杆菌的 trxB/gor），辅助二硫键正确配对。
·文库库容优化：通过电转化或化学转化构建抗体文库，库容需≥10⁸以覆盖 CDR3 的多样性。采用酵母展示系统时，可通过 CRISPR-Cas9 技术优化宿主菌株，提高超长 CDR3 抗体的表达稳定性。
四、高亲和力克隆筛选
·多轮淘选：用目标抗原（重组蛋白或病毒颗粒）对文库进行 “吸附 - 洗脱 - 扩增” 淘选（3-5 轮），逐步富集特异性结合克隆。针对牛 CDR3 识别隐蔽表位的特点，可采用 “封闭淘选” 策略（先用抗原表面暴露表位的抗体封闭，再筛选结合隐蔽表位的克隆）。
·特异性验证：通过 ELISA、流式细胞术或生物层干涉技术（BLI）检测克隆的亲和力，筛选 KD 值≤10⁻⁹M 的高活性克隆。关键验证实验包括：
1.交叉反应检测（排除与其他抗原的非特异性结合）；
2.中和活性测定（如病毒中和试验，评估对活病毒的抑制能力）；
3.结构验证（通过圆二色谱或 X 射线晶体学确认 “茎 - 旋钮” 结构完整性）。
五、重组表达与纯化
·表达系统选择：
原核表达（大肠杆菌）：适用于小批量制备 scFv 或 “旋钮” 结构域，需使用氧化还原工程菌株（如 Origami B）促进二硫键形成，表达量约 0.5-3mg/L；
真核表达（CHO 细胞或 HEK293 细胞）：适用于全长 IgG 表达，可正确进行糖基化修饰，表达量约 5-20mg/L，适合后续临床前研究。
·纯化工艺：采用 “Protein A 亲和层析 + 离子交换层析” 两步法：
第一步用 Protein A 柱捕获抗体（结合恒定区），去除大部分宿主蛋白；
第二步用阳离子交换柱（如 SP Sepharose）精细纯化，降低内毒素（≤0.1EU/mg）和聚集体（≤5%）。
六、人源化改造（如需临床应用）
·框架替换：将牛抗体的 CDR 区（尤其是超长 CDR H3）移植到人类抗体骨架（如 IGHV3-23），保留 “茎 - 旋钮” 的核心结构，降低免疫原性。
·亲和力成熟：通过 AI 辅助设计（如 AlphaFold 预测构象）或定点突变，优化 CDR 与人类骨架的相互作用，避免人源化后亲和力下降（通常需将活性保留率提升至 80% 以上）。
·功能验证：改造后需重新检测中和活性、热稳定性（Tm≥60℃）和体内半衰期（通过 Fc 段优化延长至 7-14 天）。
关键技术难点与优化
·二硫键折叠：在表达阶段加入谷胱甘肽（GSH/GSSG）调节氧化还原电位，使 “旋钮” 结构的二硫键正确配对，活性回收率提升至 70% 以上；
·文库多样性：结合单细胞测序和合成生物学技术，人工合成含不同半胱氨酸数量（4-12 个）的 CDR3 序列，扩展文库覆盖范围；
·高通量筛选：采用微流控芯片或噬菌体 - 酵母混合展示系统，将筛选周期从 4 周缩短至 10 天。