酵母双杂交实验：操作流程与关键细节

1.酵母感受态细胞制备：从菌株到活性细胞

• 菌株活化：-80℃保存的酵母菌株（如 AH109）在 YPDA 固体培养基划线，30℃培养 4-7 天，挑取单菌落接种至 3mL YPDA 液体培养基，200rpm 震荡培养 8h（OD≈0.3）。
• 扩大培养：取 10μL 菌液转接至 50mL YPDA，30℃震荡培养 16-20h 至 OD=0.15-0.3，700g 离心 5min 收集细胞，用 30mL 无菌水重悬后再次离心。
• 感受态制备：沉淀用 3mL 1.1×TE/LiAc 重悬，分装为 100μL / 管，6000g 离心 30s 后，用 500μL 1×TE/LiAc 重悬，即得感受态细胞。
  2.转化与筛选：从质粒到阳性克隆
• 转化体系：100μL 感受态细胞 + 两种重组质粒（各 1μg）+500μL PEG/LiAc 溶液，30℃、220rpm 震荡培养 30min，加 70μL DMSO 混匀，42℃热激 40min，冰浴 2min。
• 筛选培养：100μL 菌液涂布于 SD/-Trp-Leu（二缺）培养基，30℃培养 3-4 天，验证转化成功；挑取单菌落转接至四缺培养基（SD/-Trp-Leu-His-Ade），观察生长及显色情况。
  3.关键注意事项：避免实验 “踩坑”
• 培养基需新鲜配制，确保营养缺陷筛选的严谨性；
• 质粒用量需精准（1μg / 种），过量可能导致非特异性结合；
• 增设对照：阳性对照（pGBKT7-P53+pGADT7-T）、阴性对照（pGBKT7-Lam+pGADT7-T），排除假阳性。
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