酵母单杂交技术：原理与基础流程

一、核心原理
酵母单杂交（Y1H）基于转录因子的 DNA 结合域（BD）与转录激活域（AD）分离特性，实现 DNA - 蛋白质互作检测。将目标 DNA 序列（如顺式作用元件）与报告基因串联构建诱饵载体，同时将转录因子基因与 AD 融合构建猎物载体。若转录因子结合目标 DNA，AD 会激活报告基因表达，通过酵母表型（如选择性培养基生长、显色）判断互作关系。
二、实验关键步骤

• 载体构建

1. 诱饵载体：将目标 DNA（<20 bp 顺式元件建议串联 2-3 次）克隆至报告载体（如 pAbAi、pHis2），置于报告基因（HIS3、AbAr 等）上游。
2. 猎物载体：将转录因子基因与 AD（如 GAL4-AD）融合，插入表达载体（如 pGADT7）。

• 酵母转化与筛选
  共转化诱饵与猎物载体至特定菌株（如 Y1HGold、Y187），通过缺陷型培养基（SD/-Leu/-Trp）筛选转化子。
  阳性筛选：在含筛选剂（3-AT、AbA）的培养基中培养，仅互作组可存活（报告基因激活提供抗性）。
• 结果验证

1. 阳性对照：已知互作的转录因子 - DNA 对（如 p53-DNA）验证系统有效性；
2. 阴性对照：无关转录因子或 DNA 排除非特异性结合；
   结合强度可通过筛选剂浓度梯度实验评估。
   三、核心应用

• 鉴定与特定 DNA 序列结合的转录因子；
• 定位转录因子的 DNA 结合位点；
• 解析基因表达调控机制（如启动子与转录因子的互作）。