慢病毒包装原理解析

1 慢病毒简介

​ 慢病毒（Lentivirus）属是反转录病毒科（Retrovirus）下的一个属，病毒含有RNA-DNA聚合酶(RNA-directed DNA polymerase)亦即反转录酶(retrotranscriptase)做为复制之用。

2 慢病毒载体

​ 慢病毒载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。简单点说就是HIV的升级版，HIV只能感染CD4+T细胞，对我们实验来说肯定不行，所以需要改装让病毒感染亲嗜性增强。HIV还有一个有点就是可以将自己的基因组整合到宿主的基因组中，利用这个特性可以方便我们进行稳转细胞株的建立。

2.1 逆转录病毒分类

• 致瘤病毒（导致癌症）；
• 慢病毒（导致慢性病）；
• 泡沫病毒（不导致疾病）。

2.2 逆转录病毒基因组核心成分

• gag 包含组成病毒中心和结构的蛋白质的基因(Gag, group specific antigen)

• pol 包含逆转录酶的基因(Pol, polymerase)

• env 包含组成病毒外壳的基因(envelope)。

​ Gag形成病毒核心，pol编码各种RNA相关酶，env编码外壳蛋白。

2.3 慢病毒代表HIV基因组

分类	基因名	初级蛋白产物	成熟蛋白产物
病毒结构蛋白	gag	Gag多聚蛋白	MA, CA, SP1, NC, SP2, P6
	pol	Pol多聚蛋白	RT, RNase H, IN, PR
	env	gp160	gp120, gp41
必要调控元件	tat	Tat
	rev	Rev
其他调控蛋白	nef	Nef
	vpr	Vpr
	vif	Vif
	vpu	Vpu

table. HIV基因组编码蛋白

• Env 编码Env蛋白。该蛋白包括包膜糖蛋白前体gp160、包膜糖蛋白gp120和gp41。gp160在蛋白酶作用下分解为gp120和gp41两种包膜糖蛋白。gp120暴露于病毒包膜之外称外膜蛋白，感染细胞时可与细胞的CD4受体蛋白结合；gp41称跨膜蛋白，镶嵌于病毒包膜脂质中。

• RT 逆转录酶

• RNase H RNA酶

• IN 整合酶

• PR 蛋白酶

• **Tat ** 调节病毒RNA基因组的反转录，确保有效的合成mRNA，并调节细胞释放病毒颗粒，是HIV-1复制所必需的转录激活因子。Tat蛋白是一种反式激活因子，与LTR上的应答元件结合后能启动及促进病毒基因的mRNA 转录。

• Rev 调节病毒蛋白的表达，Rev是HIV-1复制所必需的，缺少Rev功能的前病毒具有转录活性，但不能表达晚期基因，不能产生病毒粒子。

• LTR 长末端重复序列（LTR），反转录病毒的基因组的两端各有一个长末端重复序列(5' LTR和3' LTR)，不编码蛋白质，但含有启动子，增强子等调控元件。病毒利用LTR将基因组整合到宿主基因组中。

• 顺式作用元件（cis-acting element） 位于基因的旁侧，可以调控影响基因表达的核酸序列。包括启动子（promoter） 、增强子（enhancer）、应答元件（responsive elements）等。其活性只影响与其自身同处于一个DNA分子上的基因。其本身并不编码蛋白质，可以与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。

• 反式作用因子（Trans-acting factor） 是参与调控基因转录效率的蛋白质因子，可以直接或间接识别或者结合顺式作用元件核心序列，可对基因表达产生激活或阻遏的作用。

• 反转录转座子（retrotransposon） 简称“反座子”（retroposon），是由RNA介导转座的转座子的元件，在结构和复制上与反转录病毒（retrovirus）类似，只是没有病毒感染必须的env基因，它通过转录合成mRNA，再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座，每转座1次拷贝数就会增加1份，可以增强自己的基因组。因此，它是许多真核生物中数量最大的一类可活动遗传成分。在植物中特别丰富，它们是核DNA的一个主要组成部分。

  • 病毒超家族（Viral superfamily） 这类反转录转座子可以编码反转录酶(Reverse transcripatase)或整合酶(integrases)。能自主地进行转录，其转座的机制同反转录病毒相似，但不能像反转录病毒那样以独立感染的方式进行传播；具有长末端重复序列（long terminal repeats，LTR）的转座子，这也是反转录病毒基因组的特征性结构，
  • 非病毒超家族（nonviral superfamily） 自身不能编码转座酶或整合酶，只能在细胞内已有的转座酶的作用下才能进行转座；

2.4 慢病毒载体进化

2.4.1 第一代慢病毒

​ 第一代慢病毒载体为双质粒系统，基本保留了HIV的所有组件，产毒滴度低，复制缺陷，且存在产生复制能力的活性HIV病毒的可能；

2.4.2 第二代慢病毒

​ 在第一代的包装质粒上剔除一些反式作用因子，所以还是三质粒组成。其中使用水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因替代env基因，拓宽了病毒的感染宿主细胞范围，虽然三质粒降低了病毒重组的可能，但是由于其依然保留HIV大部分附属基因，产生活性HIV依然存在可能；

​ 载体质粒：插入我们的目的片段。插入的目的片段两侧有LTR，有助于整合到宿主基因组上

• 病毒包装系统
  • 转基因质粒
  • psPAX2 gag, pol, rev包装质粒
  • pMD2.G VSV-G包装质粒

2.4.3 第三代慢病毒

​ 第三代HIV-1来源的慢病毒载体，在第二代的包装质粒基础上，将gag和pol分散到两个质粒上，这样第三代系统由4个质粒组成。

• 病毒包装系统
  • 转基因质粒
  • pRSV-Rev 编码Rev
  • pMDLg/pRRE 编码HIV-gag， HIV-pol
  • pMD2.G 编码VSV-G