RFDiffusion如何选择Hotspots？

一、理想的Hotspot特点：

特性	解释
功能性	这个残基和蛋白质功能直接相关，比如催化活性、底物结合、信号传递。
表面暴露	残基要在蛋白表面、容易被binder接触，埋藏在核心的残基不合适。
物化性质适合	热点残基最好能形成氢键、疏水作用、π-π相互作用，比如 Tyr、Trp、Arg、Asp。
高能量贡献位点	根据能量分解分析（如MM-GBSA、Rosetta接口分析），绑定能量集中在这些残基上。
结构稳定	选择那些在不同构象下都保持位置比较稳定的残基。太灵活的位置不适合做Hotspot。

二、具体选择Hotspot的方法：

方法	具体怎么做	举例
基于已有结构	看已有的蛋白-配体、蛋白-蛋白复合物结构，找出关键结合残基	查PDB结构，比如PDB 6M0J（ACE2-Spike复合物）
能量贡献分析	用分子动力学 + MM-GBSA分解各个残基对结合能的贡献	选 ΔG_binding 贡献 > 1 kcal/mol 的残基
界面分析（buried SASA变化）	看哪些残基结合前后埋藏面积变化最大（界面变化大=重要）	用软件 like PyMOL / Chimera / Rosetta InterfaceAnalyzer
序列保守性	重要功能残基通常是进化保守的，可以用Consurf或者Jalview分析
突变实验数据	文献中通常有功能性残基的突变研究，失活/失结合的残基是好Hotspot
机器学习预测 （高级）	用BudeAlaScan、KFC2、Robetta等工具预测界面热点

三、用Pymol找

整体步骤

1. 下载结构

2. 用PyMOL看表面暴露的残基

3. 找界面附近的重要残基

4. 筛选出Hotspots

第1步：下载PDB结构文件
第2步：用PyMOL打开
第3步：高亮显示表面残基

点击查看代码

# 把链A显示为表面
select chainA, chain A
show surface, chainA
color gray, chainA

# 选出暴露在表面的氨基酸
get_area selection=chain A, load_b=1  # 计算每个原子的SASA并保存到B-factor列（PyMOL的小trick）
select surface_residues, chain A and (b > 2.5)
show sticks, surface_residues
color green, surface_residues

注意，代码块中：
chain A ➔ 指定你的链

(sasa > 2.5) ➔ 选出溶剂可及面积大于2.5 Ų的原子（可能报错，所以先运行get_area...）

surface_residues ➔ 新选出的表面残基

直接 show sticks 和 color green 显示它们

第4步：找靠近催化口袋的区域

点击查看代码

# 选出锌离子和它附近的残基
select zinc, resn ZN
select pocket_near_zinc, byres (br. zinc around 8)
show sticks, pocket_near_zinc
color magenta, pocket_near_zinc

这样就能把Zn附近8Å以内的所有残基都选出来, 这些通常就是binding pocket里的核心残基

第5步：结合两者，筛选Hotspots

• 看既暴露在表面又靠近Zn²⁺ pocket的残基
• 通常这些是最有机会成为binding热点的

另外：
✅ Hotspots一般优先选：

• 疏水核心残基（Leu, Phe, Ile, Val）

• 电荷中心残基（Arg, Asp, Glu）

• 有可能形成氢键的残基（Ser, Thr, Asn, Gln）

✅ 最好至少挑3~5个Hotspots，设计的时候要求binder靠近它们