Functional connectomics spanning multiple areas of mouse visual cortex

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(2021)

 

ABSTRACT

　　自现代神经科学出现以来，通过将单个神经元活动的功能表征与底层电路架构相结合来理解新皮层的综合方法的价值就已被理解。然而，在实践中，解剖连接性和生理学大多是分开研究的。继先前在同一组织中结合生理学和解剖学的研究的脚步，在这里我们提出了一个独特的功能连接组学数据集，其中包含来自初级视觉皮层(VISp)和三个高级视觉区域(VISrl,  VISal和VISlm)，这是在老鼠观看自然电影和参数刺激时记录的。功能数据与自动分割的相同体积的电子显微镜(EM)数据共同注册，重建了超过200000个细胞(神经元和非神经元)和5.24亿个突触。随后对该体积中一些神经元的校对产生了重建，包括完整的树突树以及局部和区域间的轴突投影。最大的校对兴奋性轴突达到19毫米的长度并形成1893个突触，而最大的抑制性轴突形成10081个突触。在此，我们将此数据集作为开放访问资源发布给科学界，其中包括一组分析工具，可以通过编程方式和通过Web用户界面轻松访问数据。

 

INTRODUCTION

　　生理学家和解剖学家长期以来一直对大脑皮层着迷，但除了一些突出的例子之外，神经元功能和结构传统上是分开研究的。在1970年代，生理学和解剖学结合起来研究视觉皮层中的单个神经元，方法是通过细胞内记录视觉反应，然后使用光学显微镜进行染料填充和形态重建(Kelly and Van Essen 1974; Gilbert and Wiesel 1979)。这些实验的目的是将神经元的感受野与其形状和解剖位置联系起来。这种方法还与电子显微镜(EM)相结合以识别连接规则(E. L. White and Keller 1987; J. C. Anderson et al. 1994)，但通常每只动物只产生一个或几个细胞，因此很难将神经元集合的结构和功能联系起来。

　　从那时起，使用大规模电生理学和钙成像记录大量单个神经元的活动成为可能。今天，数万或数十万个神经元的视觉反应可以同时跨越清醒行为动物的多个皮层区域进行成像(Stringer et al. 2021; Demas et al. 2021；Walker et al. 2019)。详细解剖、连续切片电子显微镜的"黄金标准"也已扩大到更大的体积，包括整个苍蝇大脑(Zheng et al. 2018)和一立方毫米的人类颞叶皮层(Shapson-Coe et al. 2021)。通过结合这些技术进步，应该有可能获得适度体积皮层内所有细胞的生理学和解剖学的统一图像。

　　理解跨层和跨区域的皮层计算需要包含整个树突轴、整个局部电路和跨越分布式大脑区域的体积。认识到这一机会，IARPA皮质网络机器智能(MICrONS)计划于2016年启动，以协调可扩展技术的开发和多模态数据集的生成，这些数据集捕获了这种规模的结构-功能关系。

　　在此，我们介绍了第一个大规模MICrONS数据资源，它基于从P75-87雄性小鼠的大约1 mm³ (1.3✕0.87✕0.82 mm³，体内尺寸)的视觉皮层获取的生理和解剖数据。该数据集在几个关键方面非常出色：它是迄今为止发布的最大的功能连接组学数据集，也是按最小维度、细胞数量和检测到的突触数量计算的最大连接组学数据集，比之前发布的来自MICrONS程序的试点数据集大400倍。由于其规模和位置，该数据集包含多个皮质视觉区域，可以进行区域内和区域间连接分析。我们将这些原始数据和衍生数据产品称为MICrONS多区域数据集。该资源由多种数据类型(图1)组成，可在www.microns-explorer.org在线获取。

　　简而言之，从跨越初级视觉皮层部分和三个高级视觉皮层区域的立方毫米体积获得光和电子显微图像。从出生后P75到P81天，通过双光子显微镜在体内对体积进行成像，雄性小鼠在兴奋性细胞中表达基因编码的钙指示剂，而小鼠则观看自然电影和参数刺激。在P87时，相同的体积由串行部分EM离体成像。由于光和电子显微图像可以相互配准，这些原始数据产品原则上包含体积中单个细胞的组合生理和解剖信息，其覆盖范围是前所未有的完整性。

　　从钙图像中，我们使用受约束的非负矩阵分解方法提取了大约75000个锥体细胞对视觉刺激的反应(Giovannucci et al., 2019)。这包括体积中具有胞体的大多数神经元。从EM图像中，使用卷积神经网络自动分割细胞和细胞核(K. Lee et al. 2017; Lu, Zlateski, and Sebastian Seung 2021; Wu et al. 2021)。分段形态用于自动将细胞分类为神经元与非神经元，并将神经元进一步分类为兴奋性和抑制性细胞类别。

　　早在1960年代就已经假设神经元的感受野或偏好刺激高度依赖于它与其他神经元的连接性(Hubel and Wiesel 1962)。我们的资源可用于研究此类假设，因为在EM图像中可以看到神经元之间的突触。原则上，应该可以提取75000个锥体细胞的接线图，并根据它们的视觉反应对其进行分析。

　　提取此接线图是一项重大挑战。神经元之间的突触通过卷积神经网络自动检测并分配到突触前和突触后段。由于存在分割错误，自动分割的细胞需要由人类专家进行编辑。 这个"校对"过程对于重建准确的神经连接尤为重要。然而，原始的未经校对的分割通常足以将细胞识别为属于特定的神经元或非神经元类别。

　　严格来说，将突触分配给突触前和突触后细胞会产生完整且准确的接线图，仅适用于已完全校对并完全包含在体积内的神经元。然而，对于许多问题，由于自动树突分割的高质量(见讨论)，我们可以从已经部分校对或根本没校对的神经元中提取有关连接的有用信息。

　　即使我们扩展到任何大脑区域或物种，也很少有结合钙成像和连续切片EM的研究(Vishwanathan et al. 2017; Bae et al. 2018; Briggman, Helmstaedter and Denk 2011; Wanner and Friedrich 2020)。钙成像和连续切片EM在皮层的先前应用产生了数十个接线图(Bock et al. 2011; W.-C. A. Lee et al. 2016)或数百个细胞(Dorkenwald et al. 2019; Schneider-Mizell et al. 2020; Nicholas L. Turner 2020)。在此，我们扩大到75000个具有视觉响应的细胞，以及一个有可能随着校对的进行而增长到同样大的接线图。

 

Data products

 

RESULTS

Overview

 

Functional Data

Neurophysiology Overview

 

Two-Photon Calcium Imaging

 

Behavioral Monitoring

 

Visual Stimulation

 

Two-Photon Structural Stack

 

Electron Microscopy Imagery

 

Tissue sample

 

Multiscope autoTEM imaging

 

Volume assembly

 

Segmentation of voxels and meshes

 

Synaptic connectivity

 

Proofreading status

 

Nucleus Segmentation and Cell Classification

 

Functional - Structural Co-registration

Correspondence points and co-registration transform

 

Cell Matching

 

Integrated Analysis

 

DISCUSSION

　　由于电子显微镜被认为是识别突触的黄金标准之一，大多数数据集(包括我们的)都是为了解决连接性问题而生成的。然而，MICrONS数据集的规模和高分辨率提供的信息远比连通性更丰富、更令人感兴趣。例如，图像还揭示了细胞的细胞内机制，包括细胞核、线粒体、内质网和微管等重要亚细胞结构的形态。此外，分割包括非神经元细胞，如小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质前体细胞和少突胶质细胞，以及皮层脉管系统的精细形态。

 

Comparison with other EM connectomics studies

 

The importance of functional connectomics

 

METHODS

Mouse Lines

 

Timeline

 

Surgery

 

Two Photon Imaging

 

Monitor Positioning

 

Imaging Site Selection

 

Two Photon Functional Imaging

 

Two Photon Structural Stack

 

Eye and Face Camera

 

Treadmill

 

Stimulus Composition

 

Natural Visual Stimulus

 

Global Directional Parametric Stimulus ("Monet")

 

Local Directional Parametric Stimulus ("Trippy")

 

Stimulus Alignment

 

Oracle Score

 

Manual Matching

 

Tissue Preparation

 

Transmission Electron Microscopy Imaging

 

Volume Assembly

 

Segmentation

 

Synapse detection & assignment

 

Nucleus detection

 

Proofreading

 

Co-registration Transform

 

Cell Classification