单细胞测序 UMI 10X Barcode

为了减少由于扩增引起的误差，人们在一些单细胞测序的步骤中增加了 UMI（unique molecular identifiers），UMIs 是由 4-10 个随机核苷酸组成的序列，在 mRNA 反转录后，进入到文库中，每一个 mRNA，随机连上一个 UMI，因此可以计数不同的 UMI，最终计数 mRNA 的数量。

10X genomics单细胞测序通过Barcode来标记细胞，UMI 来标记转录本，这样与参考基因比对后就可以定量细胞以及基因的数量。
Cell Ranger 进一步将外显子reads与参考转录本比对，寻找兼容性。注释到单个基因信息的reads认为是一个特异的转录本，只有注释到转录本的reads才用于UMI计数。

 

在逆转录的过程中，有些方案利用独特分子标识符（UMI）对单分子进行标记，这些是随机的六核苷酸，可以更精确地定量单细胞中mRNA分子的初始量。之后，通过体外转录或PCR扩增cDNA，然后将扩增好的cDNA文库用于文库制备和高通量测序。

UMIs

另一种标准化方法是使用 Unique Molecular Identifiers (UMIs)(Kivioja et al. 2012). UMIs是一种随机条形码（barcode）序列，长度在4-20 bp之间。 在扩增步骤之前（通常在反转录期间），UMIs被添加在每个转录本cDNA的3’或5’端。之后，对转录本末端进行靶向测序。这些barcodes使得在扩增步骤之前，可以对转录本进行定量。虽然UMIs消除扩增偏好性的效果非常好，但是不合适用于研究基因异构体和allel特异表达。

barcode : 每一个单细胞的cDNA文库，就带上了独一无二的barcode了,barcode是用来区分细胞的，跟umi不同。
UMI：（Unique Molecular Identifiers）是短序列，用于唯一标记样品库中的每个分子。UMI被广泛用于测序应用，大多关于DNA和cDNA的PCR重复。UMI去重复还可用于RNA-seq基因表达分析和其他定量测序方法。简而言之：UMI是唯一可识别的短序列，作为UMI是唯一的，所以我们可以知道在PCR扩增的过程中哪些是由同一条DNA扩增出来的。

基于标签（barcode）的单细胞识别，给每个细胞加上独一无二的DNA序列，这样在测序的时候，就把携带相同barcode的序列视为来自同一个细胞了。这种策略，可以通过一次建库，测得数百上千个单细胞的信息。

每一个油滴中会落入一个细胞以及一个凝胶微珠，那么在每一个凝胶微珠中上长满了不同的Cell Barcode和UMI Barcode连接形成的序列，再加上一端PolyT的抓手，构成我们的捕获凝胶微珠。而这个凝胶微珠抓手就会使用oligo dT抓住mRNA构建文库。

 

10X的基本技术原理：一个油滴=一个单细胞=一个凝胶微珠=一个RNA-Seq
BD的基本技术原理：一个微孔=一个单细胞=一个磁珠=一个RNA-Seq

 

REF
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