WGA(全基因组扩增)技术

 

 

作为一种增加有限DNA量的方法,全基因组扩增技术于1992年出现,该方法特别适于法医学鉴定和遗传疾病的研究,以及如二代测序技术和CGH阵列(比较基因组杂交)等新技术应用,后者的主要难题就在于DNA样本数量有限,但分析需求量又很可观。目前业界已经开发出多种WGA技术,它们之间的实验方案和复制准确度有所不同。

 

 

业界已经开发出多种WGA技术;不过这些技术在其扩增准确性和易用性等方面有所区别。多重置换扩增(MDA)的WGA技术,能够提供无偏差的准确全基因组扩增

 

基于PCR的WGA技术

基于PCR的WGA技术主要有两种:

简并寡核苷酸PCR (DOP-PCR)技术(1)

扩增前引物延伸(PEP)技术(2)。

 

这两种技术之间的主要区别在于PEP技术使用随机引物和低PCR退火温度,而DOP-PCR技术则使用半简并寡核苷酸(例如CGACTCGAGNNNNNNATGTGG)和更高的退火温度

 

两种方法中都使用了Taq DNA聚合酶,使得扩增长度限制在3 kb(平均片段长度为400–500 kb)以内,并且会在扩增序列中引入一些错误。

 

不仅如此,有研究发现这些技术的基因组覆盖度不够完整,并会在扩增中产生偏向性——由于引物优先结合某些特定区域,造成DNA扩增产物中的一些序列相对增多。

 

多重置换扩增的WGA技术

多重置换扩增(MDA)的恒温基因组扩增技术,该技术包含了随机六聚体与变性DNA的结合过程,以及使用聚合酶在恒定温度下进行的链置换合成过程。每个置换链上添加引物后,形成分枝状的DNA结构网络。

聚合酶不会从基因组DNA模板上面解离下来,这使得生成的无偏差DNA片段可延伸至100 kb。

该酶还具有3’端→5’端的外切酶校正活性,相比基于Taq DNA聚合酶的方法,能够提供高达1000倍的保真度(参见上述基于PCR的WGA技术)。

聚合酶由独特的优化缓冲液进行支撑,能够方便的克服如发卡环一类的二级结构困难,在扩增过程中避免滑脱、定制和聚合酶解离等现象的发生。

这样无偏差的DNA片段能够合成至100 kb的长度。

 

参考来源:

http://www.liankebio.com/wap/article-894.html

 

 

 

 

posted on 2019-12-12 20:23  BPSO_mynotes  阅读(2657)  评论(0编辑  收藏  举报

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