文献精读｜不是所有突变都能成为靶点：个体化癌症疫苗的新抗原筛选逻辑

Franziska Lang 等，Nature Reviews Drug Discovery，2022，21:261-282。https://www.nature.com/articles/s41573-021-00387-y
主题：如何把肿瘤突变转化为可用于个体化癌症疫苗的候选新抗原，以及这一过程涉及的免疫学、计算方法和临床转化问题。
阅读提醒：算法和工具部分反映的是论文发表时（2022年）的研究状态；本文最重要的概念贡献是按临床情境把新抗原分为 guarding、restrained 和 ignored 三类。

一、摘要与导论：为什么需要个体化新抗原疫苗

肿瘤细胞的体细胞突变可产生异常蛋白；异常蛋白经加工后形成突变肽，并以肽-MHC复合物的形式呈递到细胞表面。能被自体CD4+或CD8+ T细胞识别的突变肽称为新表位（neoepitope），其来源蛋白可称为新抗原（neoantigen）。由于这些突变通常不在健康组织中表达，也未在胸腺建立中枢耐受，新抗原是相对肿瘤特异且安全的免疫治疗靶点。

肿瘤突变数与T细胞浸润以及多种癌症对免疫治疗的总体响应相关，但“有突变”不等于“有免疫反应”：突变必须被表达、加工、装载到患者特定HLA上并被合适的TCR识别。自然发生的T细胞反应通常只识别单个肿瘤约1%-2%的突变，而且不同新表位的抗肿瘤效力并不相同。绝大多数体细胞突变又是患者特有的，因此需要从患者肿瘤和正常组织取样，经测序、突变识别、新抗原预测、候选排序、个体化生产和接种，形成“每位患者一种配方”的治疗模式。
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图1：个体化新抗原疫苗的完整流程

  1. 取得肿瘤样本和正常对照样本（如PBMC）。
  2. 对肿瘤与正常DNA/RNA进行测序并比较，识别肿瘤特异性非同义突变。
  3. 结合转录表达、HLA结合/呈递、与自身序列的差异、克隆性、驱动/乘客属性、关键基因LOH等特征排序。
  4. 选择若干候选新表位，用mRNA、长肽、DNA或病毒载体等平台按需生产多靶点疫苗。
  5. 疫苗将足量抗原递送给淋巴结中的树突状细胞，启动新生T细胞反应或增强既有反应。
  6. 激活的CD4+和CD8+ T细胞进入肿瘤，识别并杀伤肿瘤细胞。

本节名词

  • 新表位（neoepitope）：由肿瘤特异性突变产生、并被MHC/HLA呈递的肽。
  • 新抗原组（neoantigenome）：某位患者肿瘤中全部新表位-MHC组合的集合。
  • 非同义突变（non-synonymous mutation）：导致蛋白氨基酸序列发生变化的突变。
  • 突变组（mutanome）：一个肿瘤中全部非同义体细胞突变的集合。
  • 过继性T细胞转移：从患者肿瘤或血液中取得T细胞，在体外扩增或改造后回输。
  • PBMC：外周血单个核细胞，常作为正常样本或免疫学检测材料。
  • GMP：good manufacturing practice 药品生产质量管理规范；个体化疫苗也必须通过标准化、可验证的GMP流程生产。

二、新抗原的呈递与识别

2.1 新抗原呈递

肿瘤细胞内源性蛋白经蛋白酶体降解，肽段进入内质网并装载到MHC-I，随后呈递给CD8+ T细胞。MHC-I由HLA-A、HLA-B或HLA-C编码的α链与β2-微球蛋白组成，几乎表达于所有有核细胞，主要展示细胞内来源肽。

MHC-II主要由HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ编码，主要表达于专业抗原呈递细胞（APC）；肿瘤细胞通常不表达MHC-II，但可在IFNγ作用下诱导表达。MHC-II更常呈递外源蛋白或进入内吞/分泌通路的内源蛋白，其肽长度和序列限制较MHC-I宽松，因此突变组特别可能产生丰富的MHC-II新表位并引发CD4+ T细胞反应。同一个突变若同时进入两条加工通路，并能结合患者相应的MHC-I和MHC-II等位基因，就可能同时刺激CD8+和CD4+ T细胞。

肿瘤内DC、巨噬细胞和B细胞可通过巨胞饮、吞噬凋亡囊泡、吞噬肿瘤细胞或Fc受体摄取免疫复合物等方式获得肿瘤抗原。肿瘤内APC主要负责再次激活已经完成初始启动的记忆T细胞，而不是直接启动初始T细胞。
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2.2 初始T细胞的启动

初始T细胞几乎只能在引流淋巴结中由高度专业化的DC启动。新抗原可作为可溶性物质经淋巴液到达淋巴结，也可先由肿瘤中的迁移性APC摄取，再转交给淋巴结驻留DC。内吞抗原通常进入MHC-II通路；DC还可把外源抗原导入胞质、经蛋白酶体加工后装载到MHC-I，这称为交叉呈递，是启动细胞毒性CD8+ T细胞的关键。

初始启动取决于肽-MHC复合物的密度与稳定性、T细胞前体频率、TCR功能亲和力以及共刺激信号。初始T细胞需要较高水平的抗原呈递；一旦形成记忆T细胞，再激活所需的抗原量可低约50倍。肽-MHC数量又由突变基因表达量、肽-MHC结合亲和力和复合物稳定性共同决定。低于临界呈递水平时，既不会形成有效免疫，也未必会诱导耐受。

2.3 免疫耐受

胸腺中的中枢耐受会清除对正常自身抗原具有高反应性的T细胞。新抗原通常在个体发育后才出现，因此相应T细胞一般不会因该突变表位而在胸腺中被删除。不过，它们仍可能受到外周耐受，包括克隆删除、转化为调节性T细胞、无反应或耗竭。

本节名词

  • MHC/HLA：MHC是主要组织相容性复合体；在人类中称HLA。本文有时按一般机制写MHC，按患者等位基因写HLA。
  • APC：抗原呈递细胞，包括DC、巨噬细胞和B细胞等。
  • DC：树突状细胞，是启动初始T细胞最重要的专业APC。
  • 交叉呈递（cross-presentation）：DC将摄取的外源抗原装载到MHC-I并启动CD8+ T细胞的过程。
  • 中枢耐受：在胸腺中清除强烈识别自身抗原的T细胞。
  • 外周耐受：在胸腺外删除、抑制或使自身反应性淋巴细胞失能的机制。
  • 无反应（anergy）：T细胞接触抗原后进入低反应状态，再遇相应抗原也不能充分应答。
  • 耗竭（exhaustion）：长期抗原刺激下T细胞逐渐丧失效应功能的状态。
  • 共刺激：除TCR识别外，初始T细胞充分激活所需的第二类信号。

三、TCR多样性、TCR简并性与异源免疫

TCR通过接触从MHC结合槽向外突出的少数肽侧链识别肽-MHC复合物。一个相同的新表位-MHC复合物可以被多个α/β链不同的TCR识别，这称为TCR多样性。与自身蛋白差异越大的新表位，越可能保留丰富的高反应性T细胞库，因为这些T细胞不易被中枢耐受清除；移码indel或融合基因形成的全新序列通常比单个氨基酸替换更“非己”。
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反过来，一个TCR也能识别多个不同的肽-MHC复合物，这称为TCR简并性。这些肽未必有明显序列同源性，只要向TCR呈现的关键三维和化学特征相似，就可能发生交叉反应。因此，过去由共生菌、病原体或持续感染病毒抗原建立的记忆T细胞，可能交叉识别后来出现的肿瘤新表位；由无关抗原预先建立的交叉反应性T细胞影响另一种疾病，称为异源免疫。

这里必须区分两种关系：肽-HLA亲和力决定肽能否稳定呈递；TCR-肽/HLA识别决定T细胞能否读出这个复合物。异源免疫不会改变肽-HLA亲和力，而是利用数量更多、反应更快、激活阈值更低的记忆T细胞，使少量或不稳定的新表位呈递仍可能产生反应。这可能解释为何TIL无偏筛选发现，超过四分之一的新抗原特异性反应针对预测HLA弱结合（>500 nM）的新表位；但作者使用“may explain”，说明这是一种机制性解释，并非对每个病例的直接证明。

本节名词

  • TCR多样性（TCR diversity）：同一个肽-MHC复合物能被多个不同TCR识别，即“一个表位对多个TCR”。
  • TCR简并性（TCR degeneracy）：同一个TCR能识别多个不同肽-MHC复合物，即“一个TCR对多个表位”。同一个TCR可以识别多种不同的肽–HLA复合物。不同抗原肽即使序列并不相似，只要形成的肽–HLA复合物具有相似的关键结构或化学特征，就可能被同一个TCR识别。TCR简并性描述这种“一对多”的识别能力，交叉反应则是这种能力在不同抗原之间的实际表现。
  • TCR交叉反应：TCR简并性在两个具体抗原之间的实际表现。
  • 异源免疫（heterologous immunity）：由无关抗原预先诱导的交叉反应性T细胞免疫，常在肿瘤发生前已经存在。
  • TIL：肿瘤浸润淋巴细胞。

四、新抗原驱动的免疫效应机制

在共刺激条件下，初始CD4+和CD8+ T细胞被启动、克隆扩增，离开淋巴结并分化为效应和记忆T细胞，进入肿瘤。CD8+ T细胞主要直接杀伤呈递相应MHC-I新表位的肿瘤细胞；CD4+ T细胞通过细胞因子和炎症重塑肿瘤微环境，也可直接杀伤表达MHC-II的肿瘤细胞。两者协同对于有效抗肿瘤免疫十分重要。

T细胞识别抗原后分泌IFNγ，可上调肿瘤细胞和APC的MHC-I/MHC-II呈递，使肿瘤更容易被识别。肿瘤细胞死亡会释放更多抗原，继而激活针对原治疗靶点之外的其他表位和抗原的T细胞，这称为抗原扩展。抗原呈递、T细胞启动、迁移、杀伤、再次释放抗原的循环称为癌症-免疫循环；癌症疫苗的目标就是从零启动新抗原特异性T细胞或增强既有T细胞，使这一循环持续到肿瘤清除。

这一循环会受到免疫抑制机制制约。MHC-II新表位还可能扩增FOXP3+调节性T细胞（Treg），从而以抗原特异方式抑制抗肿瘤反应。它们可能来自耐受条件下的低效启动，也可能来自既有交叉反应性Treg，机制尚未确定。

本节名词

  • TME：肿瘤微环境，由肿瘤细胞、免疫细胞、基质和可溶性因子等组成。
  • Treg：调节性T细胞，通常表达FOXP3，可抑制免疫反应。
  • PD1/PDL1：免疫检查点受体及其配体；持续信号可抑制T细胞功能。
  • 抗原扩展（antigen spreading）：免疫反应从最初靶点扩展到治疗未直接包含的其他表位或抗原。
  • 癌症-免疫循环：抗原释放、呈递、T细胞启动与迁移、肿瘤杀伤和再释放抗原构成的正反馈循环。

五、免疫监视、免疫逃逸与免疫编辑

免疫系统可识别并清除癌前或恶性细胞，这一假说称为免疫监视。与此同时，免疫压力会选择出更能逃逸的肿瘤克隆，形成免疫编辑。肿瘤可通过PDL1、TGFβ、Treg等建立免疫抑制性微环境，也可选择性丢失被T细胞识别的新抗原。新抗原丢失在免疫浸润充分的未经治疗肿瘤中较常见，在缺乏免疫浸润的肿瘤中较少，支持“免疫压力塑造肿瘤”的观点。

更根本的逃逸包括HLA位点杂合性丢失、MHC下调或突变、TAP异常和β2-微球蛋白突变。这些改变破坏抗原加工/呈递，使依赖新抗原特异性T细胞的治疗整体失效，因此需要与不依赖相同机制的疗法联合。
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图4：克隆性决定靶向覆盖范围

  • 主干克隆新抗原存在于原发灶和全部转移灶，靶向后覆盖最广。
  • 主干新抗原也可能在某个转移灶中因缺失或沉默而丢失。
  • 转移灶私有克隆新抗原只覆盖某个转移灶。
  • 亚克隆新抗原只覆盖某个病灶中的一部分细胞。
    每个转移灶都像一个独立“岛屿”，具有自己的免疫微环境、演化路径和新抗原组，因此晚期多转移疾病的免疫逃逸风险更高。多新抗原疫苗可降低因单一靶抗原丢失导致的逃逸。ICB还可能促进抗原扩展，但治疗后也会选择出不表达相关新抗原的耐药亚克隆。

本节名词

  • 免疫监视（immune surveillance）：免疫系统持续发现并清除癌前或恶性细胞的假说。
  • 免疫编辑（immunoediting）：免疫与肿瘤相互作用经历清除、平衡和逃逸三个阶段，最终选择出更能逃避免疫的克隆。
  • LOH（杂合性丢失）：一个原本有两个不同等位基因的位点丢失其中一个拷贝。
  • 克隆性（clonality）：携带某突变的肿瘤亚克隆所占比例。
  • 克隆突变：存在于肿瘤全部亚克隆中的突变；实际判定依赖样本和算法，并无完全统一阈值。
  • 主干突变（truncal mutation）：肿瘤演化早期出现、通常覆盖较多病灶和细胞的突变。
  • 分支突变（branched mutation）：演化后期出现、只存在于部分肿瘤细胞的突变。

六、新抗原的两套分类方法

6.1 按分子来源分类

SNV：单核苷酸变异

多数SNV导致一个氨基酸替换，是癌症中最常见、研究最充分的新抗原来源。SNV负荷与ICB疗效相关，SNV新表位也已用于黑色素瘤和胶质母细胞瘤个体化疫苗。共享SNV有标准化开发潜力，但受突变本身发生率和HLA限制，实际覆盖人群通常很小。

Indel：插入/缺失

移码indel可生成与正常蛋白完全不同的新序列，通常比SNV更“非己”、更可能具有免疫原性；但也可能产生提前终止密码子并触发无义介导的RNA降解（NMD）。能逃避NMD的indel与ICB响应的相关性优于一般indel或单独SNV。低SNV负荷癌种中较多的indel可能扩大新抗原治疗适用范围。共享例子包括NPM1外显子12插入、CALR外显子9 indel和TGFBR2 poly(A)区缺失。

融合基因

染色体内或染色体间重排可连接两个无关基因，产生融合接头新序列，如BCR-ABL1。融合事件总体较少，多数仍为患者个体特有，但在低SNV负荷肿瘤中可能成为关键新抗原来源。文中共享例子包括BCR-ABL、DEK-CAN、SYT-SSX、PML-RARA、PAX-FKHR和ETV6-AML1；另有低SNV负荷头颈癌患者对DEK-AFF2融合产生T细胞反应。

剪接变体

癌细胞异常剪接可通过外显子跳跃、内含子滞留或替代剪接位点产生新序列。若体细胞突变直接导致异常剪接，其肿瘤特异性较可信；若剪接异常来自表观遗传变化，某一正常细胞谱系本来就可能表达该异构体，因此不能自动认定为肿瘤特异，必须核查正常组织表达。

共享新抗原的总体限制

共享靶点不仅要在多人中出现，还必须由患者携带的特定HLA等位基因呈递；“共享突变率 × 合适HLA频率”共同决定实际覆盖率。因此，少数共享靶点可做通用治疗，但更广泛利用肿瘤突变仍需个体化路线。

6.2 按临床功能情境分类

作者认为，仅按突变类型不足以回答“哪个新抗原在特定临床情境中最有治疗价值”，因此提出正交的情境分类：守卫型（guarding）、受抑型（restrained）和忽视型（ignored）新抗原。

七、守卫型、受抑型与忽视型新抗原

7.1 Guarding neoantigens：守卫型新抗原

定义：在没有免疫治疗的情况下，其肿瘤内表达已经足以产生具有临床意义的自发抗肿瘤免疫，影响肿瘤自然病程和预后。

守卫型有两种机制：

  1. 至尊型（supreme）守卫新抗原：表达量高，肽-MHC结合亲和力和稳定性极强，可在肿瘤形成早期强力启动细胞毒性T细胞，在免疫抑制性TME成熟前限制生长和转移。此类事件极罕见，最强证据主要来自高突变负荷小鼠肿瘤；相应新抗原丢失后，肿瘤可重新生长。

  2. 异源免疫型守卫新抗原：被病原体、共生菌或持续病毒预先建立的交叉反应性记忆T细胞识别。它不需要很高的新抗原呈递量，可能在肿瘤早期就发挥作用，也可解释部分HLA弱结合新表位的T细胞反应。在这里插入图片描述

胰腺癌长期生存者的候选新表位同时具有“更像病原体表位”和“突变肽较野生型肽有更强HLA结合”两个特征。差异性结合指数（DAI）较高也与黑色素瘤和肺癌生存改善相关。守卫型可被ICB或疫苗进一步增强，但由于很早就受到免疫压力，也更容易发生早期免疫编辑和抗原丢失。

在异源免疫中，既往感染产生的病原体抗原会建立相应的记忆T细胞；肿瘤发生后，某些突变肽–HLA复合物可能恰好被这些记忆T细胞交叉识别。记忆T细胞数量更多、反应更快、激活阈值更低，因此即使肿瘤新表位与HLA结合较弱（预测IC50 >500 nM）、呈递数量较少，也可能将其激活。这并不是记忆T细胞提高了肽与HLA的亲和力，而是它们对少量肽–HLA复合物更加敏感。因此，异源免疫可能解释为什么TIL筛选能发现不少针对HLA弱结合新表位的T细胞反应，但这仍是一种机制性解释，并非所有此类反应都已被证明由异源免疫引起。

7.2 Restrained neoantigens：受抑型新抗原

定义：能够在未经治疗的宿主中启动新抗原特异性T细胞，但这些T细胞数量不足、功能受损或被成熟TME压制，无法控制肿瘤；ICB可将其重新激活并扩增。

此类新抗原必须在肿瘤中有较强表达、较高MHC结合或较稳定的肽-MHC复合物，才能在淋巴结达到启动初始T细胞的较高阈值。它们的识别标准不是自然预后，而是能否预测ICB等免疫调节疗法带来的临床获益。与ICB响应相关的特征包括克隆性、较高变异等位基因频率、一项突变产生多个可呈递表位、较高DAI，以及来源于难以丢失的驱动突变。SNV、移码突变和融合基因都可能成为受抑型新抗原。

7.3 Ignored neoantigens：忽视型新抗原

定义：肿瘤能够呈递，但自然呈递水平低于启动初始T细胞的阈值，因此治疗前没有可检测或有临床意义的自发反应；疫苗把足量抗原递送给淋巴结DC后，可以从零启动具有抗肿瘤能力的T细胞。

“自然情况下未被识别”不等于“不能成为好靶点”。小鼠研究中，测序发现的突变有15%-40%可在接种后产生强烈新生T细胞反应，且CD4+反应多于CD8+；部分反应可使已建立肿瘤缩小或排斥，并引发抗原扩展。多项早期临床试验中，约70%被选入疫苗的突变在接种后产生免疫反应，且绝大多数治疗前不可检测。证据还包括疫苗诱导T细胞进入肿瘤、体外杀伤自体肿瘤细胞、病灶缩小或复发减少。

忽视型新抗原可能由“低表达+强HLA结合”“高表达+弱HLA结合”或“中等表达+中等结合”等组合产生中等水平呈递：不够启动初始T细胞，但已足以被疫苗生成的记忆/效应T细胞识别。它们数量丰富，尤其适合构建多特异性疫苗或个体化TCR工程细胞治疗。

7.4 三类新抗原对照

类型 治疗前是否已有反应 主要障碍 最相关临床意义 文中估计频率
守卫型-至尊型 有且强 极其罕见，且易被免疫编辑 无免疫治疗时也改善自然病程 极罕见
守卫型-交叉反应型 有，来自既有记忆T细胞 依赖个体既有记忆TCR库 早期自然免疫控制 全部突变中<2%
受抑型 有，但功能受抑或数量不足 TME抑制、T细胞耗竭 ICB临床活性的主要靶点 全部突变中<2%
忽视型 通常没有 淋巴结呈递量不足，未启动初始T细胞 疫苗从零扩展T细胞靶谱 约15%-25%

7.5 治疗策略含义

三类新抗原不是互斥治疗选择，而应组合进入多新表位疫苗。守卫型和受抑型虽少，但在早期或辅助治疗中有价值；忽视型提供大量新靶点，可扩大低突变负荷肿瘤的多特异性T细胞反应。疫苗诱导的T细胞会表达PD1，因此疫苗与ICB可协同：疫苗扩大T细胞靶谱，ICB维持其功能并可能降低启动阈值、促进抗原扩展。即使ICB单药无效，患者仍可能因疫苗先建立新的T细胞反应而获益。

本节名词

  • 差异性结合指数（DAI）：突变肽与对应野生型肽对MHC-I的预测结合亲和力之差。
  • 驱动突变：提高肿瘤细胞适应性并推动肿瘤发生发展的突变。
  • 乘客突变：没有充分证据表明其驱动肿瘤的突变；“乘客”不一定真的可有可无，只是尚未证明其功能。
  • 免疫优势（immunodominance）：多个抗原共存时，免疫反应集中于少数表位的现象。
  • 本文特定的 antigenicity：作者用来指疫苗接种后诱导的反应，主要对应忽视型新表位。
  • 本文特定的 immunogenicity：作者用来指无需疫苗即可自然诱导的反应，主要对应守卫型和受抑型。注意：这一对用法与不少教材或论文的常规宽泛定义可能相反，复习时应标注“本文定义”。
  • 肿瘤排斥抗原：能导致肿瘤排斥的抗原；但小鼠实验可指未经处理、预接种、预接触同源/异源肿瘤、治疗已建立肿瘤或配合ICB等完全不同情境，不能脱离实验设计比较。

八、新抗原候选预测：免疫生物学驱动的特征

候选新抗原的最低条件是：突变基因被转录和翻译，蛋白被正确加工，突变肽被患者HLA呈递，并能被T细胞识别。当前流程最基础的两项是确认突变转录本表达和预测HLA结合；其他特征则估计T细胞识别概率和肿瘤通过抗原丢失逃逸的风险。问题在于各特征应如何加权尚无定论，而且用于训练的T细胞数据往往混合了守卫型、受抑型、忽视型及异源免疫反应，临床情境不统一。

8.1 转录表达

肽-MHC密度通常随蛋白和转录本丰度上升。高表达新抗原更容易在ICB下被清除，肿瘤也可通过下调其表达逃逸；高转录量还可补偿较弱的MHC结合。因此，高表达对预测自然启动或受抑型新抗原尤其重要。疫苗和过继细胞治疗可主动建立T细胞反应，因而可适当纳入较低表达候选，扩大靶点范围。

表达通常从肿瘤bulk RNA-seq中测量，并同时寻找突变和野生型转录本。kallisto等工具可用伪比对快速估计转录本丰度。

8.2 MHC结合、稳定性与表面呈递

突变肽能结合患者至少一个MHC等位基因是T细胞识别的基本前提。CD4+与CD8+ T细胞协同很重要，因此个体化疫苗应兼有MHC-I和MHC-II候选，而不应只追求CD8+靶点。

NetMHCpan、MHCflurry等使用结合实验和/或质谱洗脱配体训练；MixMHCpred主要根据洗脱配体预测表面呈递。NetMHCpan还能利用HLA序列同源性推断罕见等位基因的结合偏好。肽-MHC复合物稳定性可能比瞬时结合亲和力更能预测免疫反应，因为稳定复合物有更长时间被TCR识别；NetMHCstabpan用于稳定性预测。HLA-I位点保持完全生殖系杂合的患者具有更广的可呈递肽谱，在ICB治疗中生存可能优于某些位点纯合患者。

NetChop和NetCTL可预测蛋白酶体切割及TAP转运。但如果呈递模型本身以MHC洗脱配体训练，这些配体已经历了上游加工，额外叠加切割、转运和结合模型是否增益明确，作者持保留态度。

8.3 与自身的差异、与病原体的相似

突变肽与对应野生型肽及整个自身蛋白质组差异越大，越可能存在未被中枢耐受删除的高反应性T细胞。可用BLAST比对、核相似度或其他序列距离估计“非己性”，这一特征对移码indel和融合序列可能比对SNV更有价值。

另一方面，新表位与常见病原体表位相似，可能利用已有交叉反应性记忆T细胞，成为异源免疫型守卫新抗原。胰腺癌研究提示，“病原体相似性 + 突变肽相对野生型肽的HLA结合改善”组合可区分长期与短期生存者。

8.4 TCR识别预测

相关方法尝试预测肽上面向TCR的侧链、利用肽-MHC稳定性间接估计TCR识别，或把TCR氨基酸序列输入神经网络，预测其与特定肽-MHC的结合及反向寻找同源靶标。由于MHC-肽-TCR组合空间巨大、结构复杂且训练数据不足，这些方法在论文发表时仍不成熟。

8.5 突变克隆性与不可丢失性

PyClone、SciClone等根据变异等位基因频率推断克隆结构，但准确性受肿瘤纯度、拷贝数和样本代表性影响，低纯度或单点活检很难可靠重建整个肿瘤。主干/克隆突变比亚克隆/分支突变覆盖更多细胞，通常更值得优先考虑。

驱动突变往往较早出现、克隆性高且不易丢失，可通过COSMIC、DriverDB等数据库识别。但计算研究提示，共享驱动突变整体上可能比乘客突变更少被MHC-I/MHC-II呈递。对疫苗而言，抗原的“非己性”和可呈递性可能比它在肿瘤生物学上是否为驱动更重要。

8.6 关键基因的LOH

若一个生存必需基因发生LOH，而剩余等位基因上的突变产生新抗原，肿瘤不能轻易通过删除该等位基因逃逸，否则会失去生存所需基因。因此，“必需基因 + LOH + 可呈递突变”是理论上很有吸引力的稳定靶点。深度测序或芯片可预测LOH，功能敲除研究已建立约1,600-2,500个候选必需基因列表。

8.7 论文表3中的主要预测特征/工具

  • HLA-I/HLA-II结合：NetMHCpan、NetMHCIIpan等。
  • 表面呈递：MixMHCpred、MixMHC2pred。
  • 转录表达：FPKM、RPKM、TPM，常用kallisto等
  • 克隆性：突变/野生型reads和拷贝数等，常用PyClone。
  • DAI：突变肽与野生型肽的HLA-I结合差异。
  • 自身相似度/新抗原非相似度：突变肽与野生型肽或整个自身蛋白质组的距离。
  • 病原体相似度：与IEDB病原体表位做BLAST比对。
  • PHBR-I/II：综合患者多个HLA等位基因对某突变的最佳呈递排名。
  • Generator rate：一个突变产生多个可呈递新表位的能力。
  • Recognition potential：综合病原体相似性和突变/野生型结合差异。
  • Vaxrank、Priority score：综合变异表达、HLA结合、VAF等多项特征。
  • T cell predictor、neoag：用随机森林或梯度提升整合序列与生物学特征。

本节名词

  • 伪比对（pseudoalignment）：判断RNA测序read最可能来自哪些转录本，但不逐碱基给出完整比对。
  • ROC曲线：随阈值变化绘制真阳性率与假阳性率，用于评价分类器；ROC-AUC越大通常表示区分能力越好。
  • TAP复合物：由TAP1/TAP2组成，把胞质肽转运进内质网供MHC-I装载。
  • BLAST：在数据库中寻找与查询生物序列局部相似区域的工具。
  • VAF（变异等位基因频率）：覆盖某位点的reads中携带突变的比例；受克隆性、肿瘤纯度和拷贝数共同影响。
  • 锚定位点（anchor residues）：肽中嵌入MHC结合槽、对MHC结合偏好起关键作用的位置。
  • TCR朝向残基：从MHC槽向外突出、主要与TCR接触的肽残基。

九、机器学习与深度学习方法

机器学习是让算法从数据中学习模式，可分为监督学习和无监督学习；深度学习通常使用具有多个隐藏层的人工神经网络。训练时，输入层接收数值化特征，隐藏层通过权重和非线性变换提取模式，输出层给出预测，再用损失函数比较预测与真实标签并更新权重。

神经网络可用结合实验、单等位基因细胞系的免疫肽组数据或肽-MHC三维物理化学特征训练。深度模型有机会发现现有生物学假说未捕捉的复杂序列规律。论文列举：HLAthena预测MHC-I呈递，NeonMHC2预测MHC-II呈递，EDGE预测MHC-I呈递，MARIA结合表达和侧翼序列预测MHC-II呈递，DeepHLApan结合MHC-I结合与免疫反应模型，结构模型则利用TCR/肽结合能等特征。

这些模型的主要局限是：高质量、标准化、带可靠阳性和阴性标签的T细胞反应数据太少；数据集常不平衡；未区分自然免疫反应与接种后反应；多等位基因质谱数据需要准确拆分到具体HLA；深度模型可解释性不足。因此，2022年时深度学习表现有希望，但尚不能代替严谨的生物学验证和临床情境划分。

本节名词

  • 人工神经网络：受生物神经网络启发、通过多层加权计算学习输入与输出关系的模型。
  • 监督学习：使用带真实标签的数据训练预测模型。
  • 无监督学习：没有预先标签，算法自行寻找数据结构或模式。
  • 损失函数（loss function）：量化模型预测与真实结果差异的函数，训练目标是降低损失。
  • 主动学习：模型主动选择最有信息量的样本进行标注或实验，以较少数据提高性能。
  • 迁移学习：把在一个数据集或任务中学到的模式迁移到相关但数据较少的新任务。

十、临床转化中的技术挑战

10.1 生物样本不是肿瘤全貌

肿瘤具有空间和时间异质性；同一病灶不同区域、不同转移灶以及原发灶的突变谱都可能不同。历史原发灶样本有助于寻找早期主干突变，近期转移灶样本更能反映当前新抗原组。守卫型新抗原可能已因免疫编辑在转移灶中丢失；忽视型新抗原未经历强烈免疫选择，可能跨病灶保存得更好。

单次活检可能既不能代表病灶内部，也不能代表多转移疾病；但多区域、多病灶重复取样又侵入性强、难以常规实施。新鲜冷冻样本质量最佳但物流复杂；FFPE样本常见但甲醛固定会造成测序伪影；小活检可能肿瘤含量不足。ctDNA液体活检更方便，也可能综合多病灶信息，但突变等位基因频率低，且当时技术更多局限于预设突变面板，距离高灵敏、无偏全景检测仍有差距。

10.2 Mutation calling：突变识别

流程包括read清洗、与参考基因组比对，以及从测序错误、制样伪影和生殖系变异中识别真正体细胞突变。不同caller对SNV、indel、融合、拷贝数和异质性的能力不同，没有单一完美工具，实践中常采用多个caller交集或共识。SNV检测最成熟，indel和融合的灵敏度、特异度仍较差。

低肿瘤纯度、拷贝数变化和亚克隆会压低突变信号。例如只有30%肿瘤纯度且野生型等位基因重复时，杂合突变read比例可能降到5%以下，难以与噪声区分。因此需要融合DNA、RNA、拷贝数和多样本信息，并建立结构化、可复现的分析工作流。

论文列举的caller包括MuTect/MuTect2、Strelka/Strelka2、VarScan2、SomaticSniper、RADIA、FreeBayes、samtools/bcftools、Platypus、CaVEMan、cgpPindel、SvABA、MuSE、SMUFIN、GATK及深度学习工具NeuSomatic。该清单是2022年的技术快照，不宜直接视为当前最佳实践。

10.3 数据集的可用性与质量

不同研究在测序、突变检测、候选筛选和T细胞检测上缺乏统一方案。测试对象通常先经过“看起来最可能阳性”的筛选，导致数据集正负样本不平衡和选择偏倚；不同研究还混合了不同ICB、辅助治疗/晚期治疗、CD4+/CD8+反应、自然/ICB/疫苗诱导反应。

ELISpot、细胞内细胞因子染色、流式和肽-MHC多聚体等实验的灵敏度和所检测表型不同。低灵敏度可漏掉治疗前低频反应，把真正守卫型或受抑型误判为忽视型。缺少完整实验与临床元数据时，简单合并多个研究做meta分析可能得出误导结论。

TESLA联盟尝试构建协调数据集，但HLA和TCR高度多态、患者内外差异巨大，可靠模型可能需要数千甚至更多标准化观测，而当时只有数百例。客观缓解、无进展生存和总生存等长期临床终点，需与免疫学标签一起纳入训练和验证。

10.4 疫苗设计与生产

疫苗设计包括“选平台”和“选一组新表位”两部分。临床研究通常每位患者纳入2-20个突变；合成长肽、mRNA、DNA和病毒载体理论上可递送数十个突变。因此可同时组合MHC-I/MHC-II、克隆/亚克隆、忽视型以及少量守卫型和受抑型候选，降低对单一预测假说押注的风险。

文中平台包括15-30个氨基酸长肽配合poly-ICLC佐剂、编码多个候选串联序列且具有内在佐剂活性的mRNA、病毒载体和DNA。不同平台的加工、呈递、佐剂和接种程序不同，会影响同一候选是否真正诱导反应，也使跨试验比较更加困难。

平台还决定生产速度、规模化能力和成本。个体化药物不是传统的单一产品大规模扩产，而是大量并行的“一人一批”小生产任务。理想平台应合成化、快速、低成本、流程稳健且符合GMP；未来可通过全流程数字化、机器人、云控制工厂和并行微型生产线提高可行性。

本节名词

  • 序列比对（sequence alignment）：把测序read映射到参考基因组以确定来源位置。
  • 突变识别/变异检测（mutation calling）：从测序数据中判定真实体细胞变异的过程；文中也用来指多个caller取共识的策略。
  • FFPE：福尔马林固定、石蜡包埋样本，易保存但可产生特定测序伪影。
  • ctDNA：血浆中的循环肿瘤DNA。
  • ELISpot：以单细胞斑点形式检测抗原刺激后细胞因子分泌的实验。
  • 肽-MHC多聚体：用多个相同肽-MHC复合物标记具有相应TCR的T细胞。

十一、临床应用、监管与软件验证

个体化疫苗仍需在随机试验中证明相对标准治疗的临床优势。与传统药物不同，每位患者获得的活性序列组合不同，药物在试验进行中才根据患者样本按需设计和生产。因此监管对象不能只是一种固定化合物，而必须覆盖从取样、测序、算法选择、疫苗设计到生产放行的整个标准化流程。

较理想的临床情境可能是微小残留病灶：肿瘤负荷低、免疫抑制尚未完全建立，且疫苗生产周转时间不那么致命。大肿瘤负荷往往需要联合治疗。新表位疫苗通常耐受性较好，与ICB联用可维持疫苗诱导T细胞功能；若肿瘤通过丢失抗原或抗原呈递系统逃逸，则可联合不依赖HLA肽呈递的CAR-T、抗体或双特异性T细胞衔接器。

技术和分析软件验证

新抗原选择高度依赖软件，进入临床后必须证明系统“适合预定用途”。GAMP是自动化系统验证的重要行业框架，要求从用户需求、功能需求和配置需求，到组件及系统测试均有文档，并在每个阶段评估患者安全风险。

全外显子测序涉及约5,000万个基因组碱基数据点，偶然假阳性不可避免，因此需验证重复性、覆盖度、低质量样本处理能力和突变识别稳健性。机器学习工具的训练数据会持续增长，即使算法结构不变，模型性能也可能不断改善。监管的关键难题是：如何允许临床试验和已批准产品中的算法、数据和设计流程持续迭代升级，同时保持产品安全、一致和可追溯。

本节名词

  • 微小残留病灶（MRD）：治疗后体内仍残留但负荷很低、可能尚不能常规影像检出的肿瘤。
  • CAR-T：通过嵌合抗原受体直接识别细胞表面抗原的工程T细胞，通常不依赖HLA呈递。
  • 双特异性T细胞衔接器：一端结合肿瘤抗原、一端结合T细胞，将T细胞牵引到肿瘤细胞旁发挥杀伤。
  • GMP：良好自动化生产实践，用于受监管计算机化系统的验证与质量管理。
  • 分析验证：证明检测或计算流程的准确性、稳健性、重复性及适用范围。

十二、展望

NGS、计算能力和算法推动新抗原领域快速发展，早期个体化疫苗试验已显示单药或联合PD1/PDL1阻断的抗肿瘤活性。更高分辨率测序和MHC配体组质谱将降低噪声，并帮助发现来自非编码区、基因组“暗物质”和非经典翻译的新抗原。

未来预测不应只停留在“突变肽能否结合HLA”，还要整合TCR序列、肽-MHC-TCR结构以及患者免疫记忆。标准化实验设计、灵敏且可复现的计算流程、完整生物学和临床元数据，是建立可靠人工智能模型的前提。本文提出的情境分类可使训练数据与临床问题匹配：守卫型用于理解自然免疫控制，受抑型用于预测ICB获益，忽视型用于预测疫苗能否从零建立反应。

最终愿景是动态个体化治疗：在某一时间点为患者选择当前最相关的新抗原，同时持续测序监测肿瘤演化和获得性耐药，再根据新出现或丢失的靶点调整后续加强针，使疫苗配方随疾病变化而更新。

本节名词

  • MHC配体组/免疫肽组（immunopeptidome）：细胞表面MHC实际呈递的全部肽集合，常通过免疫沉淀和质谱分析。
  • 基因组暗物质（dark matter）：功能尚不清楚、过去较少纳入蛋白编码分析的基因组区域。
  • 非经典翻译：不按传统已注释蛋白编码框架产生肽的翻译事件，可能提供额外新抗原来源。

十三、总结

1. 新抗原从突变到杀伤必须跨过多道关卡

体细胞突变
→ 突变转录本表达
→ 蛋白翻译和加工
→ 突变肽结合患者HLA
→ 形成足量且稳定的肽-HLA复合物
→ 在淋巴结启动初始T细胞或在肿瘤中激活记忆T细胞
→ CD4+/CD8+ T细胞扩增并进入肿瘤
→ 识别肿瘤细胞并产生杀伤
→ 肿瘤在免疫压力下发生编辑和逃逸

任何一步失败，都可能使“有突变”无法转化为“有效新抗原”。因此，单独预测HLA结合远远不够。

2. 决定新抗原价值的四个层次

  1. 来源层：SNV、indel、融合、剪接及未来的非编码/非经典翻译来源。
  2. 呈递层：表达量、加工、HLA结合、复合物稳定性、患者HLA多样性。
  3. 识别层：自身差异、病原体相似性、TCR多样性、TCR简并性和既有记忆T细胞库。
  4. 疾病层：克隆性、跨病灶分布、驱动/必需性、LOH、TME抑制和免疫编辑。

3. 文章最重要的三类新抗原

  • 守卫型：无需治疗就能影响自然病程；要么自身呈递极强，要么借助异源免疫记忆T细胞。
  • 受抑型：已经启动T细胞，但被肿瘤压制；ICB可解除制动。
  • 忽视型：自然呈递不足以启动初始T细胞；疫苗通过提高淋巴结抗原递送从零建立反应。

这一分类说明，“自然免疫原性不强”不代表“不适合做疫苗”。相反，数量丰富的忽视型新抗原正是个体化疫苗扩大T细胞靶谱的主要资源。

4. 个体化疫苗的合理设计原则

  • 同时覆盖MHC-I和MHC-II，促进CD8+与CD4+协同。
  • 组合多个靶点，降低抗原丢失和肿瘤异质性导致的逃逸。
  • 优先考虑表达、呈递、稳定性、克隆覆盖和不可丢失性，但不把任何单一分数当作真理。
  • 同时纳入少量守卫型/受抑型高价值靶点和较多忽视型可诱导靶点。
  • 将疫苗与ICB等机制互补的治疗联用；若抗原呈递通路缺失，应考虑不依赖HLA的疗法。
  • 预测模型必须匹配具体临床情境，并用标准化T细胞反应和临床结局验证。

5. 全文总结

个体化新抗原疫苗的核心不是简单寻找“预测HLA结合最强的突变肽”，而是结合突变来源、表达与呈递、TCR识别、既有免疫记忆、肿瘤克隆结构、免疫抑制和临床治疗情境，选择一组互补且不易逃逸的新抗原，通过疫苗建立或扩大多特异性T细胞反应，并随肿瘤演化持续更新治疗策略。

posted @ 2026-08-17 12:59  生信探索  阅读(4)  评论(0)    收藏  举报