调节酶DNA电路的可编程引物开关

在本文中，作者提出了一个引物开关调节Primer Switching Regulation(PSR)策略，可编程和动态调节酶的DNA回路与一个脚掌辅助策略。

图1A
图1A左图表示一种基础的链置换，得到想要的输出；右图是输入片段与粘性末端相贴合，底物里有聚合酶，个人理解是聚合酶在粘合后输入链的3'端聚合成新的一段挤掉原来的一段链，原来的一段链脱落成为输出信号。如图1E所示。

图1E

图1B

图1C，D 图1B的设计引物A1最初与DNA杂交，复合体(B1/S1)形成“关闭”状态(复合体A1/B1/S1)。在这种情况下，“YES”门不能触发，因为引物A1的凸出物有效地抑制了扩增聚合酶(图1C，红色箭头)。

切换到“YES”门从“OFF”到“ON”状态，一个开关线(DNA)
B1/S2)通过toehold介导与引物A1结合SDR形成完整的杂化(图1C，蓝色的箭头)。“YES”门随后被酶激活，通过聚合酶扩增输出DNA信号B1(图1C, D)。

在这项工作中，作者构建了6种psr调节的酶DNA回路，电路的功能是通过控制信号的传输路径来实现的，包括级联、扇入、扇出、双路、前馈、反馈电路。通过这种方法，可以实现复杂的电路功能。只需引入额外的开关线即可实现，无需重建基本电路框架。

1. Basic Primer Switching Regulation (PSR).

基本引物开关调节
基本PSR由三部分组成，即引物A1、栅极(B1/S1)和开关线(B1/S2)(图1C)。在初始阶段，通道(B1/S1)与引物A1通过分子相互作用杂化得到带引物A1的凸起的复合体1 (A1/B1/S1)。酶促SDR不能启动,由于复合体1的凸起物，它禁止产生输出B1。相反，开关线(B1/S2)由底物S2，能与引物A1完全杂交(图1c)。值得注意的是，引物A1与门(B1/S1)，可以作为一个潜在的信号资源连接到开关线(B1/S2)。没有引入开挂线(B1/S2)，引物信号资源A1仍然存在，通过引入一根开关线(B1/S2)，最初与栅极(B1/S1)杂交的引物A1通过熵驱动的SDR离解，与开关线(B1/S2)形成复合物2 (A1/B1/S2)。随后，由于复合体2的凸起不存在，酶促SDR产生输出B1。因此,成功调控了A1的传递路径.

图1E, F 图1E, F中作者研究了引物对酶的调控电路。此外,还测试了引物A1对的浓度变化评估开关线对监管效果的影响(B1 / S2)。本文主要浅显的了解电路的基本原理，这里选择性忽略一些证明作者的研究是可靠的对照实验，

2. Cascaded PSR Circuit.

级联PSR电路。理论上PSR可以应用于任何位置的酶电路，因为连续性在级联电路中的引物传输。开关线的性能如图2A和B所示以级联电路4为例(图2A, B)，在初始状态下，级联电路4由门1组成(B1/S1)，2 (C1/S4)和3 (D1/S6)。最初，所有的门都打开了“OFF”状态，从而引物从上游传输，下游被打乱了。开关线的介绍1启动具有门1的PSR以产生输出B2。随后，输出B2被引入门2。然而,由于门2处于“OFF”状态，因此无法产生输出C2。同样，在门3和开关线3之间也会产生一个PSR，从而产生输出D2，最终实现基于多个PSR的级联电路的引物传输调节。
（Gate1代表闭合的门，Gate1+代表“On”状态）

图2A，B

3. Path-Edited PSR Circuit.

路径编辑PSR电路。

图3A

作者设计了一个具有扇出网络结构的电路，其中包括门1、门4和门5(图3A)。引物A1作为门1、门4和门5的输入。这些门处于“OFF”状态，引物A1无法启动聚合酶扩增产生输出B2、C2和D2。因此，作者设计了通过PSR产生可选输出的开关线1、4和5(图3A)。如图3A所示，引入开关线1时，1门与开关线1之间发生PSR，将引物A1传递到开关线1，产生输出B2。然后，输出B2与报告门相互作用，显著增强FAM的荧光强度(图3A, B)。过量的引物A1使开关线4通过门4触发其PSR(图3A)。该事件使引物A1传输到开关丝4，随后产生输出C2，诱导HEX荧光显著增加(图3C)。同样，通过引入开关线5，可以产生输出D2，增强了ROX的荧光强度(图3D)。

4. Resource Allocation PSR Circuit.

资源分配PSR电路。
通过将双轨电路与PSR相结合，可以对引物资源进行可编程调节。引物资源分配电路的架构如图4A所示，由双轨电路和开关线9、10、1组成。轨道1由9+、1和F1门组成。当输入E1加入栅极9+时，聚合酶扩增开始产生输出A1。但是，由于门1处于“OFF”状态，虽然门1可以接收到输出A1，但是不能产生输出。轨道2由栅极10+、栅极11+和栅极R1组成，不添加输入。开关线9和10可以将引物资源从栅极1分配到栅极11+和R1，激活磁道2中的ROX荧光。开关线1可分配1门剩余引物资源产生输出B2, B2可输入F1门产生1道FAM荧光。

图4A

5. Feedforward PSR Circuit.

基本前馈电路由门1、门2+、门7+、门F2和开关线6、开关线16组成(图5A)。对于正前馈路径，开关线6位于门1和门F2之间，将引物资源从门1传送到门F2，激活门F2触发清晰可见的荧光信号(图5A, B)。对于负前馈路径，开关线16也位于门1和门F2之间。然而，与开关线6不同的是，开关线16不激活栅极F2，而是通过引入一个悬空位置消耗该栅极(图5A)。

图5A

6. Catalytic PSR Circuit.

催化PSR电路。
该催化PSR电路的设计细节如图6A至6E所示。产生输出E1的催化电路的正向路径由门2+和门12+形成，而恢复输入B2的反馈路径由开关线17形成。在反馈通路中缺少开关线17的情况下，电路无法恢复输入B2以促进正反馈催化。然而，当反馈路径中存在开关线17时，触发PSR产生双输入B2，从而重新激活并增强正向路径。

图6A

综上所述，本研究提出的PSR提供了一个高度可编程和灵活的动态工具调节引物以执行复杂的电路功能酶的电路。随着智能化的快速发展，大规模，模块化的DNA电路，引物开关调控在DNA中有着广泛的应用计算，生物传感和分子模式识别。

原文doi：10.1021/acsnano.3c12000