蛋白组学之外泌体

1. 外泌体研究背景：
      胞外囊泡是从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体，主要由微囊泡、凋亡小体、外泌体组成。而外泌体是其中一类小囊泡，直径为30~150nm，密度1.10~1.18 g/ml，可携带核酸、蛋白质质和脂质等，存在于血液、唾液、尿液等多种体液中。
      越来越多的研究证实，外泌体可以通过细胞间转移核酸、蛋白质、脂质等特定物质，发挥特殊的功能。如在抗原提呈细胞中呈递抗原程中、肿瘤细胞发生发展、神经细胞信号转导过程中都发挥着重要作用。对外泌体的分析和检测可以辅助疾病的早期诊断、疗效评价和预后分析。

           外泌体组成

 

2. 外泌体的分离：

       超速超速离心法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。Johnstone等最初发展了超速离心法用于网织红细胞组织培养液中外泌体的分离；Thery等对该方法进行了优化，改进后的方法见图1。以300g、2000g和10000g离心，分别去除细胞、死细胞和细胞碎片；利用超高速离心(>100000g)得到外泌体的粗提取物，重复操作2次，以去除污染蛋白质，从而得到外泌体。该方法被广泛应用于各类生物样品，如血清、血浆、细胞培养液、尿液、唾液和脑脊液等的分析，是目前应用最为广泛的外泌体分离方法，也是目前的“金标准”。

       许多公司先后开发了一系列针对不同样品来源(血清、血浆、细胞培养液、尿样等)的外泌体提取试剂盒，其核心试剂之一是聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)，实现外泌体的快速分离和纯化。如用于尿液外泌体分离的ExoQuick、Pure-Exo、Total Exosome Isolation等产品，但这些商品化的试剂盒价格昂贵。近年有国内外研究人员还描述了一种以PEG为基础的ExtraPEG技术，通过对大体积培养液低速离心沉淀后的小体积超速离心，快速而廉价地富集外泌体。但利用PEG沉淀外泌体还存在其他不少问题：纯度和回收率低、杂蛋白较多(假阳性)、颗粒大小不均一、产生难以去除的聚合物、机械力或者吐温-20等化学添加物部分破坏外泌体等。

3. 外泌体的鉴定是继分离后又一个困扰研究者的问题。

      鉴定方式不外乎就是下面这三种：

       1）形态学（电镜）；

       2）粒子大小（径粒分析）；

       3）标志蛋白（WB）。

        

4.得到了外泌体之后如何做？

       外泌体携带大量功能性的miRNA，少量的mRNA、lncRNA，以及特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。对外泌体验明正身之后，就可以在蛋白水平和核酸水平对其进行检测和深入分析了。

          

 

       由于外泌体中含有较多降解的短RNA片段，测序时会成为背景干扰有效数据，通常都建议使用芯片的方法检测外泌体miRNA。而对于lncRNA来说，大部分在细胞内低表达，在外泌体中丰度就更低了，对于低丰度基因，芯片检测的准确性远远大于测序，因此也建议使用基因芯片的方法检测外泌体lncRNA。

5. 外泌体主要内容物——蛋白质：

       ExoCarta——外泌体常用的数据库 (http://www.exocarta.org)，记录了超过286个外泌体研究的数据，其中就包含有41860种蛋白质，是所有记录的外泌体内容物中排名No. 1的分子。由此可见，外泌体内中的蛋白质成分在外泌体相关的生物学研究中占据着重要地位。由于外泌体中蛋白质分子具有多样性，无论从标志物角度还是疾病机制角度进行研究，外泌体蛋白质无疑会成为未来的明星分子。

       ExoCarta是首个外泌体标志物综合数据库，由Simpson教授团队建立，是一个开放的数据库平台，收录了包括人、大鼠、小鼠、绵羊、豚鼠、果蝇、马、穴兔、牛在内的几个物种共286个研究结果；涉及到不同组织器官来源的外泌体蛋白，mRNA，miRNA，脂类等信息。ExoCarta数据库的典型特点就是具有外泌体蛋白动态的蛋白与蛋白之间相互关系网以及生物学通路。用户可以从大量的研究中下载最常用的蛋白数据。下载的文件可直接导入FunRich工具，进行其他的功能富集和相互关系网分析。该数据库已经被超过16000名独立研究人员使用。

       Urinary Exosome Protein Database——尿液外泌体蛋白数据库是基于上皮系统生物实验室（ESBL）已发表的蛋白质谱数据建立的数据库(https://hpcwebapps.cit.nih.gov/ESBL/Database/Exosome/)，所有数据均来源于健康志愿者尿液外泌体。这个数据库包含了用两种不同的质谱仪来鉴定人类尿外泌体的蛋白质。

       EMBL-EBI外泌体数据库是一款针对人类外泌体蛋白GO功能分析的综合注释数据库(http://www.ebi.ac.uk/GOA/exosome)。该数据库与实验室研究人员（Dr S Mathivanan - La Trobe Institute, Dr A Kalea - UCL）及外泌体数据库Exocarta (http://www.exocarta.org/) 和Vesiclepedia紧密合作，识别用于聚焦注释的靶蛋白以及外泌体实验方法学的注释。

       Vesiclepedia是一个EVs分子数据（脂质、RNA和蛋白质）的手工检索数据库(http://www.microvesicles.org/)，收录了41个物种的1254个独立研究，349988个蛋白，27646个mRNA，10520个miRNA、639个脂质条目，还可以根据物种、囊泡、分子和样品类型浏览和检索。该数据库是公开的，允许用户根据不同的搜索标准查询和下载EV cargo、 EV分离和表征模式，生物物理和分子特性以及EV-METRIC，帮助生物医学科学家评估EV制剂的质量，获得的相应数据。此外，基于FunRich的Vesiclepedia插件可以帮助用户进行数据分析。

 

参考文章：

https://www.sohu.com/a/312659388_776073

http://www.360doc.com/showweb/0/0/901758329.aspx