玉米中的‘dosage-effect defective1’的父系印记对种子重量异质性的贡献

玉米中的‘dosage-effect defective1’的父系印记对种子重量异质性的贡献

1. 从历史上看，异质性效应曾被假设为花粉对种子表型的独特遗传贡献，但大多数例子代表了孟德尔性状的标准互补作用。我们在玉米（Zea mays）中确定了印记的剂量效应缺陷1（ded1）位点作为种子大小和发育的父系调控因子。当通过雄性传递ded1时，低表现型等位基因显示出5-10%的种子重量减少，而纯合突变体的种子重量减少了70-90%。Ded1编码一个在胚乳早期发育期间特异性表达的R2R3-MYB转录因子，具有父系等位基因偏见。DED1直接激活早期胚乳基因和毗邻胚盾细胞层的胚乳基因，同时直接抑制晚期谷物填充基因。这些结果证明了最初定义的异质性：Ded1的印记导致父系等位基因设定胚乳发育的节奏，从而影响粮食的形成和大小。

   简化总结：

   研究发现，玉米中的一个名为ded1的基因位点影响了种子的大小和发展。当这个基因通过雄性传递时，种子的重量会减少。Ded1是一个特定在胚乳早期发育时表达的转录因子，并且影响了与胚乳发育相关的基因的活化和抑制。这证明了花粉对种子表型的遗传贡献，特别是它如何影响胚乳的发育和粮食的大小。

2. 玉米（Zea mays）的胚乳构成了成熟玉米粒的主要重量。胚乳是由一个二倍体的母本中央细胞受到一个单倍体的精子细胞受精而发育起来的，母本基因组对种子表型的影响是主导的1,2。在重新发现孟德尔遗传学之前，由花粉基因型引起的种子表型被假设是由于类似于异质性的亲本相互作用，这是古希腊的客人-主人关系，其中父系基因组被视为受精后成功互动的必要角色的客人3。大多数的异质性效应揭示了孟德尔性状的显性等位基因，但由基因组印记导致的亲本来源特异性基因表达允许来自单个亲本等位基因的变异决定种子的表型4。首个被发现的印记基因是玉米的Rr等位基因5。Rr通过花粉遗传时，Rr表达的母系偏见导致玉米粒中的花青素呈现斑驳的、减少的水平。

   简化总结：

   玉米的胚乳是成熟玉米粒的大部分，主要由母体的影响下发育。在孟德尔遗传学被重新发现之前，认为花粉基因型对种子表型的影响是由于亲本间的相互作用，类似于客人-主人的关系。虽然大多数异质性效应展现了孟德尔性状的显性等位基因，但基因组印记导致的特定的基因表达允许种子表型受到单一亲本等位基因的影响。例如，玉米的Rr等位基因，当它通过花粉遗传时，会导致玉米粒的花青素减少。

3. 从等位基因特异性表达分析中，已知有100多个玉米的印记基因6,7。然而，除了Rr外，只有两个玉米的母系表达基因（MEGs），即母系表达基因1（meg1）和floury3（fl3）8-10，已被证明赋予定性种子表型。尚未知道有哪些父系表达基因（PEGs）在玉米粒发育中有功能性角色，但已报道了三种玉米父系效应种子突变体11。在此，我们展示了剂量效应缺陷1（ded1）位点是一个定量的PEG，它作为胚乳发育进程的转录调控因子，同时也促进对胚胎发育至关重要的胚乳支持基因的表达。

   简化总结：

   已知的玉米印记基因超过100个，但只有少数母系表达基因（例如meg1和fl3）对种子表型有明显影响。虽然没有已知的父系表达基因参与玉米粒的发育，但已有报道的三种父系效应种子突变体。研究指出，ded1基因是一个影响胚乳发育的父系表达基因，它同时促进了支持胚胎发育的关键基因的表达。

4. Ded1是一个影响种子重量的剂量效应基因

   我们从对1068个自花受精的玉米穗进行定量筛选中鉴定出了ded1-ref等位基因，这些玉米穗分离出了UniformMu有缺陷的玉米粒突变体12。每个玉米穗的正常玉米粒都被单独称重，并使用自定义的近红外谷物分析器13进行了成分检测。这次筛选中ded1-ref/+和+/+玉米粒重量的累积分布图显示，在玉米粒重量的下1/3与上2/3之间，存在一个2mg的步增（补充图1a）。虽然这与正态分布没有显著差异，但种子重量分布的峰度为-0.72，表明相对于平均值，上下尾部的偏差大于预期。玉米粒重量上下20%的玉米粒被分别种植在不同的培养物中，进行自花授粉，并对ded1表型进行评分（补充图1a）。这种种子重量的分类结果在ded1杂合子的频率上有显著差异。重种子更可能是纯合正常的（费舍尔确切检验，p=0.015）。

   简化总结：

   通过对1068个玉米穗进行筛选，研究者鉴定出了影响种子重量的ded1-ref等位基因。种子重量的分布呈现了特定的模式，其中重种子更可能是纯合正常的。这种重量与基因型的关联为ded1基因与种子重量之间的关系提供了证据。

5. 在W22、B73或Mo17的遗传背景中的纯合突变体通常会产生一个严重缺陷的玉米粒，其果皮几乎是空的（图1a、1b以及补充图1b、1c）。分离出ded1纯合子的玉米穗显示出变异表达性，其中0-15%的突变玉米粒是有活力的。有活力的种子发育成稍微小一些的、有生育力的植物（图1c以及补充图1d）。ded1-ref植物的自花授粉会产生所有的突变种子，这些种子在胚乳层中紫色素的积累速度加快（图1d、1e）。

   简化总结：

   在特定遗传背景中，ded1的纯合突变体产生严重缺陷的玉米粒，其中的果皮几乎是空的。虽然大多数这样的突变玉米粒是不活跃的，但仍有0-15%是有活力的，并可以发育成稍小但有生育力的植物。这些ded1突变植物的自花授粉产生的种子在胚乳层中紫色素积累更快。

6. 通过F2种群的ded1-ref突变体的整体分离分析和细致定位，ded1位点被定位到染色体1上的470 kbp区域，这一区域涵盖了9个编码蛋白的基因（补充图2a, b)。基因组测序揭示了一个copia-like逆转座子插入到R2R3-MYB转录因子基因ZmMyb73中（图1f及补充图2c)。ZmMyb73的预测mRNA序列在B73基因组注释的第2版本到第5版本中有所不同。我们放大并测序了B73 Ded1胚乳的cDNA，这确认了在B73_v4基因模型中注释的基因转录单元，Zm00001d033265。在B73_v5基因模型Zm00001eb050770中，没有找到预测的另类剪接转录本的证据。ded1-ref突变体cDNA的PCR放大了一个5'开放阅读框（ORF）产品，但没有放大逆转座子插入处3'的产品（补充图2d)。ded1-ref转录本ORF的完整cDNA序列包括逆转座子序列的一部分，以及预测的缺少C端酸性结构域的蛋白质（图1f）。使用CRISPR-Cas9对ZmMyb73进行的定向突变产生了四个插入-缺失等位基因，这些等位基因分离出了玉米粒突变体，并且不能互补ded1-ref（图1g及补充图3)。

   简化总结：

   通过分析，ded1位点被定位到染色体1的特定区域，其中有一个基因ZmMyb73受到了逆转座子的插入。这个基因的预测mRNA序列在不同版本的基因组注释中有所不同，但实验验证了特定的转录形式。此外，ded1-ref的突变版本与这个逆转座子有关，导致编码蛋白的结构发生变化。通过CRISPR-Cas9技术，研究者对ZmMyb73进行了定向突变，并证实了这些突变与原始ded1-ref的表型相似。

7. ded1-1到ded1-4等位基因导致了提前终止的密码子，这些密码子在ded1-ref的5'端截断了Ded1的开放阅读框(ORF)。通过12天授粉后的胚乳中外显子1的定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析，揭示了所有等位基因的纯合突变体中ded1的表达减少，这与转录本对无意义介导的衰减敏感是一致的（图1h）。基于玉米粒的重量和大小，突变体ded1-3和ded1-4的玉米粒比ded1-ref小（图1i以及补充图3c, e）。在ded1-ref/+和ded1-3/+或ded1-4/+之间的相互杂交产生了有缺陷的玉米粒，这些玉米粒有中间的种子重量，这表明ded1-ref是一个有泄漏的低形态等位基因。

   简化总结：

   ded1-1到ded1-4等位基因由于提前终止的密码子导致Ded1的开放阅读框被截断。这些突变版本在纯合状态下显示ded1基因的表达减少，且与非功能性介导的转录衰减相一致。某些突变体的玉米粒比ded1-ref小，并且杂交实验显示ded1-ref可能是一个不完全表达的低形态等位基因。

8. 定量印迹的ded1基因座

   公开的转录组数据显示从5到13 DAP，Ded1在胚乳中的表达，其中在6 DAP达到峰值14-16（补充图4a）。通过qRT-PCR确认了在早期胚乳中的特异性表达（图2a和补充图4b）。此外，Ded1在相互的B73和Mo17交叉的胚乳转录组实验中是一个定量的父源表达基因（PEG）6,7,17。基于这些研究，在胚乳发育的早期，Ded1的父本等位基因显示出更强的偏倚，在10 DAP占总转录本的75-77%，而在14 DAP占总转录本的53-68%6,7。

   简化总结：

   公开的数据显示Ded1基因在胚乳的早期发育中特异性表达，并在6 DAP达到最高水平。这个基因在B73和Mo17的胚乳中作为一个定量的父源表达基因被识别，特别是在胚乳发育的早期，Ded1的父本等位基因有较强的表达倾向，占据了10 DAP的转录本的大部分。

9. 基因可以显示等位基因特异的印迹效应，我们测试了W22的Ded1等位基因在与Mo17的相互杂交中的印迹效应，使用一个来自12DAP胚乳RNA的通过酶切扩增的多态性序列（CAPS）的RT-PCR检测18。AluI酶切消化可以区分W22和Mo17的等位基因（图2b）。纯合体RNA的混合模拟了基于两个母本和一个父本剂量的纯合体等位基因的预期相对表达水平。与先前的RNA-seq分析一致，相互杂交中的父本等位基因占据了总转录本的大约2/3（图2b）。从已发表的转录组研究和CAPS RT-PCR结果中，我们推断父本等位基因的一个拷贝大约比母本等位基因的一个拷贝表达高五倍。因此，当Ded1的功能丧失并通过花粉遗传时，预期对种子表型的影响会更大。

   简化总结：

   通过进行特定的RT-PCR实验，研究人员发现在与Mo17的杂交中，W22的Ded1等位基因显示了父源特异的印迹效应。特别地，父本的Ded1基因在转录中的贡献约为总转录本的2/3，其表达水平是母本的约5倍。这意味着，当Ded1功能从花粉中遗传时，对种子表型的影响可能会更为显著。

10. DED1转录因子的目标

    DED1被预测为一个转录因子，我们通过在玉米原生质体中暂时表达与增强型绿色荧光蛋白（DED1-GFP）的C末端融合来确认它定位于细胞核。DED1-GFP与来自SV40大T抗原的核定位信号（NLS）的红色荧光蛋白（RFP）融合物共定位（补充图5a）。我们还使用酵母双杂交GAL4 DNA结合结构域（BD）融合来测试DED1的转录激活功能。DED1、ZmICEa转录激活器19和非激活的LaminC蛋白作为BD载体中的翻译融合物表达。在没有激活结构域载体的情况下，DED1和ZmICEa的BD结构都表达了HIS3和ADE2报告基因（补充图5b）。结构域缺失分析确定了C-末端酸性结构域作为此检测中的激活结构域（补充图5b）。ded1-ref ORF也显示自动激活，来自DED1ref蛋白的部分酸性结构域足以进行转录激活。相反，DED1-ΔC（近似于ded1-3或ded1-4预测的蛋白）不激活报告基因。这些在转录激活中的差异可能解释了ded1-ref的漏水表型。

    简化总结：

    研究人员证实了DED1是一个转录因子，并确定它位于细胞核中。通过使用酵母双杂交系统，他们进一步证明了DED1具有转录激活能力，特别是它的C-末端酸性结构域对转录激活至关重要。此外，他们观察到，不同DED1变体在转录激活能力上存在差异，这可能解释了某些DED1基因突变的表型差异。

11.  我们通过整合突变体和正常比较中的差异表达基因（DEGs）与DED1的DNA结合位点来研究DED1发育功能的分子基础。首先，我们对来自12 DAP的纯合子ded1-ref突变体和正常同胞的胚乳转录组进行了DESeq2分析，确定了至少有log2两倍转录水平差异的DEGs。在ded1中，有1022个DEGs的表达降低，有1050个DEGs的表达增加（补充数据1）。Gene Ontology（GO）术语富集分析在增加和减少的DEGs中都发现了多种代谢和对刺激的反应术语（补充图6a, b）。

    简化总结：

    研究者探讨了DED1在发育过程中的分子功能，方法是通过比较正常与DED1突变体之间的差异表达基因和DED1的DNA结合位置。他们发现，在纯合ded1-ref突变体中，有大约1022个基因的表达降低，而1050个基因的表达增加。此外，这些差异表达的基因涉及到多种与代谢和对刺激的反应相关的生物过程。

     

12. 为了识别DED1的DNA结合位点，研究者使用了带有Halo标签的DED1蛋白来亲和纯化B73基因组片段进行DAP-seq20研究。总共找到了43,225个DED1富集的峰值，其中61.6%的这些结合位点位于15,367个注释基因的转录起始位点(TSS)和停止位点的1 kbp以内（补充图6c）。这些DED1的结合位点主要集中在TSS上游的100bp内（图3a）。DED1结合位点的基序富集分析鉴定到了一个与拟南芥的MYB11921相似的结合基序（图3b）。

    简化总结：

    研究者利用带有Halo标签的DED1蛋白来鉴定DED1的DNA结合位点。他们在B73基因组中发现了总共43,225个DED1富集的结合位点，其中大多数位于注释基因的转录起始和停止位点附近。此外，他们还确定了一个与拟南芥的MYB119相似的DED1结合基序。

13. 我们重点研究了具有DAP-seq峰值在转录起始位点(TSS)的−1kbp至+100bp范围内的5860个基因（补充数据2）。这一子集中包含了在12DAP胚乳RNA-seq中可以检测到的2762个基因，其中包括438个差异表达基因(DEGs)（补充图6d）。将启动子结合和差异表达进行叠加分析得到的结果比仅仅进行DEG分析更具统计学意义（累积超几何概率=2.2 × 10^−8），这表明具有DED1结合位点的DEGs是DED1的直接靶基因。有258个靶基因在ded1中表达减少，这意味着它们可能是DED1活化的。还有180个基因在ded1中表达增加，表明它们可能是DED1抑制的（图3c和补充数据3）。

    利用电泳迁移率偏移试验（EMSA），我们使用DAP-seq峰值中的探针验证了重组DED1-GST融合蛋白预测的结合。这些位点的子集包括floury3 (fl3)8、sucrose synthase1 (sus1)22、colored aleurone1 (c1)23和viviparous1 (vp1)24（图3d, e和补充图6e, f）。对于每一个位点，我们都证明了DED1的结合是特异的，并使用未标记的竞争探针进行了验证。对于fl3和sus1，我们还将DED1的结合基序从CAGTT替换为AGACC，以生成未标记的突变竞争物。这些突变竞争物的干扰作用不如未标记的正常竞争物，这说明DED1具有特异性地结合到CAGTT基序（图3e和补充图6f）。

    简化总结：

    研究者对DAP-seq显示的5860个基因进行了深入研究，发现其中有438个基因在DED1的缺失下表达发生了变化，这些基因可能是DED1的直接靶基因。实验进一步验证了DED1与多个基因位点的特异性结合，这些基因位点包括fl3、sus1、c1和vp1。

14. 为了更好地理解ded1基因座的发育作用，我们利用已发布的RNA-seq研究分析了Ded1和DED1直接靶基因的表达模式。具体来说，我们重新分析了从6到28 DAP的胚乳发育时间序列，以及8和13 DAP时的种子组织解剖研究15,25,26。Ded1和DED1活化的基因在6到8 DAP时达到表达高峰，主要在8 DAP种子的胚乳组织中表达（图3f、补充图7a和补充数据3）。到了13 DAP，Ded1和32%的DED1活化基因在靠近胚胎的胚乳毗邻胚珠(EAS)细胞层中达到表达高峰。EAS转录组富集了代谢物转运蛋白，这些蛋白被假设为从胚乳向胚胎导向营养。

    简化总结：

    研究者重新分析了关于胚乳发育的RNA-seq数据，发现Ded1和它的直接靶基因在6到8 DAP有高表达，并且主要在8 DAP的胚乳组织中。到了13 DAP，这些基因在靠近胚胎的细胞层中达到表达高峰，这些细胞层富含可能帮助胚乳为胚胎提供营养的转运蛋白。

15. 相比之下，DED1抑制的基因在10 DAP之后的胚乳中达到表达高峰（补充图7b）。在8 DAP时，68%的被抑制的靶基因在胚胎或aleurone中达到最高表达（补充数据3）。到了13 DAP，80%的DED1抑制的靶基因在胚胎、果皮和胚珠aleurone中达到表达高峰。重要的是，直接靶基因的表达与8和13 DAP组织解剖中的Ded1表达模式相一致。在8 DAP时，Ded1特异地在胚乳中表达，只在aleurone中有较低水平的表达，而在13 DAP时，Ded1的表达特异于EAS（图3f）。

    简化总结：

    DED1抑制的基因主要在10 DAP后的胚乳中表达。8 DAP时，大部分这些基因在胚胎或aleurone中达到最高表达；而到了13 DAP，它们大多数在胚胎、果皮和胚珠aleurone中有高表达。这与Ded1基因在这些时间点的表达模式相吻合，说明它在8 DAP主要在胚乳中表达，而在13 DAP时则主要在EAS中表达。

16. ded1剂量和杂效的发育机制

    通过对同源的ded1-ref和正常兄妹种子的组织学研究，发现ded1突变的胚乳不能支持胚胎的发育。在授粉后的12天（12 DAP）时，正常的兄妹种子已经具有完全发育的身体结构，包括胚根和胚叶（补充图8a）。相比之下，ded1的胚胎通常停止在预转换阶段（补充图8b）。此外，ded1突变体的基底胚乳传输层（BETL）发育不完全，而这一层对于从母体组织中摄取养分至关重要（补充图8c, d）。

    简化总结：

    ded1突变导致胚乳无法正常支持胚胎的发育。在授粉后12天，正常种子的胚胎已经完全形成，而ded1突变种的胚胎则停滞在发育的早期阶段。此外，这种突变还影响到胚乳的一个关键区域——基底胚乳传输层的发育，这一区域对于养分的摄取非常重要。

17. 一些DED1直接靶标基因具有明确的生物学功能，可以为我们提供关于ded1突变的发育后果的深入了解（补充图3f）。转录因子占直接靶标的7%（32/438），其中18个基因被激活，14个基因被抑制（补充数据3）。在被激活的目标中，floury3（fl3）是一个PLATZ结构域的转录因子，当它突变时，会导致不透明的胚乳和粮食填充减少的表型8。在DED1抑制的目标中，c1和pl1都是MYB转录因子，它们调控花青素生物合成23,27,28。

    其他DED1激活的目标与胚乳的发育过程有关。例如，ZmJmj11编码一个H3K27me3去甲基酶，该酶平衡与印迹基因表达相关的聚合体抑制复合物2抑制性染色质标记的活性29,30。cyclin8（cyc8）基因编码一个与胚乳早期细胞增殖相关的B2型cyclin31。色氨酸转氨酶相关基因1（tar1）合成植物激素，吲哚乙酸32。缺陷胚乳18（de18）基因编码一个与YUCCA相关的吲哚乙酸合酶，可能直接被DED1激活33。在ded1突变体中，de18的表达显著降低，de18基因在TSS上游1.8 kbp处有一个DAP-seq峰值（补充图6e）。

    简化总结：

    DED1的一些直接靶基因有着明确的功能，这些功能与植物的发育有关。其中，有些转录因子如fl3和c1、pl1在植物中起到关键作用。此外，有一些基因涉及胚乳的发育，如与染色质标记、细胞增殖和植物激素合成有关的基因。特别地，de18基因，它与植物激素的生产有关，被发现在ded1突变体中其表达量降低，而这个基因的某个区域也被DED1绑定。

18. 多个DED1直接靶标基因预计在胚乳-胚胎界面有功能。男性不育8（ms8）基因有助于花粉发育，并编码一个与花药中的分泌细胞类型相关的假设β-1,3-半乳糖基转移酶34,35。在胚乳中，ms8特异性地表达在胚胎周围区域（ESR）和EAS（图3f）。预测的转运蛋白占DED1靶标的6%（28/438）（补充数据3）。糖转运蛋白，包括sweet14a、sweet14b和sweet15a，在种子发育期间可能需要摄取糖，因为已经证明sweet4c基因对谷物充实至关重要36。尽管sweet14a和sweet14b在胚乳发育的后期表达，但这些基因在EAS中具有特异性表达（图3f）。

    还有一些直接靶标基因在种子发育期间参与蔗糖的利用。DED1直接激活蔗糖合酶1（sus1），这是一个对于营养摄取和淀粉生物合成至关重要的酶37。DED1还抑制糖增强子1（se1），它是淀粉分解基因的抑制子，在胚乳发育的晚期作用，以促进sugary1突变体中的淀粉积累38。

    DED1直接调控的基因的一系列分子功能证明ded1是一个全局调节器，它促进早期种子发育以及胚乳-胚胎之间的相互作用，同时抑制较晚的谷物充实功能。

    简化总结：

    DED1直接靶标的多个基因在胚乳和胚胎之间有关键作用。例如，ms8基因参与花粉的发育，并在胚乳中特异性表达；还有一些糖转运蛋白，如sweet14a和sweet14b，参与种子的糖摄取。此外，DED1也调控与淀粉生物合成和分解相关的基因，如sus1和se1。这些发现表明，DED1是一个全局调控器，既可以促进种子的早期发育和胚乳与胚胎的交互，也可以抑制谷物的后期填充功能。

19. 引人注目的是，DED1的直接靶标包括印迹基因（补充数据3）。六个母体效应基因（MEGs）在被DED1激活或抑制之间均分。在父体效应基因（PEGs）中，8/9的基因是DED1激活的靶标，包括tar1生产生长素的位置。de18位置是另一个参与生长素生物合成的PEG，可能直接被DED1激活。

    作为一个转录因子，人们期望ded1基因座观察到的种子重量剂量效应是通过胚乳转录水平的变化来介导的。我们生成了一个剂量系列的12 DAP胚乳RNA样本，通过对ded1-ref/+和W22植株进行控制的授粉。ded1-ref/+的自授粉产生了纯合突变的dd/d胚乳，W22的自授粉产生了DD/D（Ded1的正常表达）。互为交叉产生了预期的dd/D（2/3正常表达）和DD/d（1/3正常表达）胚乳，这些胚乳通过对胚胎进行基因型鉴定来确定。然后通过qRT-PCR分析该剂量系列，以检测正常Ded1等位基因和六个差异表达基因的表达（图4a）。为了仅测定正常的Ded1等位基因转录水平，设计引物在ded1-ref中放大跨LTR插入位点（图1f）。这些引物未能在ddd基因型中检测到Ded1转录，且显示了来源于父母的表达水平。在ddD基因型中的父本遗传具有正常DDD基因型的50% Ded1转录水平。当Ded1在DDd基因型中从母本继承时，正常等位基因的转录水平是DDD基因型的15%。这些数据与mRNA-seq研究中观察到的PEG表达模式以及图2b中的CAPS RT-PCR分析一致。

    简化总结：

    DED1的直接目标中有一些是印迹基因。这些基因在被DED1激活或抑制中均有分布。实验中，研究者创建了一个胚乳RNA样本剂量系列，通过特定的授粉方法生成。他们使用qRT-PCR技术检测了Ded1等位基因和其他六个基因的表达水平。结果显示，Ded1基因的表达受到父母遗传的影响，这与之前的研究结果相一致。

20. DED1激活的靶基因fl3对正常Ded1等位基因的增加表达呈现出一个阈值反应。在DDd基因型中，与ddd纯合突变基因型相比，fl3的表达只增加了20倍，而在ddD杂合基因型中，与ddd突变相比增加了133倍。对于潜在的直接靶基de18，也观察到了类似的阈值效应，其中DDd和ddD基因型分别比ddd高出32倍和149倍。

    没有DAP-seq结合峰的DEGs基于ded1的剂量也显示出表达水平的变化，但模式各异。sweet4c己糖转运蛋白呈现出阈值效应，与其他基因型相比，ddd纯合基因型的表达减少了约3倍。tcrr1应答调节器显示出与ded1表达相关的逐渐减少的表达。我们还分析了两个间接被抑制的基因，22kDa alpha zein5 (az22z5)和anthocyaninless2 (a2)。两者在纯合突变的ddd基因型中都显示出转录水平的增加。我们得出的结论是，ded1-ref的父传输导致大量直接和间接DED1靶标的转录水平变化。由ded1-ref的父传输导致的转录变化可能是导致分离为DDD和DDd剂量的玉米穗中观察到的种子重量减少的原因。

    简化总结：

    DED1激活的基因fl3对Ded1等位基因的增加有一个阈值反应，与其他基因型相比，其表达有显著差异。另一个基因de18也有类似的效果。没有DAP-seq的基因也根据ded1的剂量表现出不同的表达模式。分析结果表明，ded1-ref从父本传输会导致很多DED1靶基因的转录水平变化，这可能是导致某些玉米种子重量减少的原因。

21.  关于被子植物和哺乳动物中基因印迹起源的亲缘冲突或亲缘理论预测，母源表达基因 (MEGs) 和父源表达基因 (PEGs) 的选择是为了增强母系和父系基因组的繁殖能力。尽管在被子植物中有许多例子显示 MEGs 在种子发育中起到了关键作用，但我们知道的唯一一个直接调控种子发育的 PEG 是 ded1。在多种植物物种中已经鉴定出数百个 PEGs。然而，对拟南芥中的一部分 PEGs 进行突变后，并没有明显影响种子的形态。因此，ded1 在与亲缘冲突理论的关系中提供了一个关键例子。遗传来自父系的 Ded1 基因足以促进胚胎发育和正常的种子重量。而遗传来自母系的 Ded1 能确保种子发育，但重量较轻。Ded1 的亲源表达模式和种子重量结果说明，父系遗传的功能性 Ded1 增加了营养物质的摄取和种子储备的积累。

    简化总结：

    亲缘冲突或亲缘理论认为基因印迹的起源是由于亲源对种子发育的不同利益导致的。在被子植物中，有很多证据表明 MEGs 对种子发育至关重要。但 ded1 是我们知道的唯一一个直接控制种子发育的 PEG。在某些植物中对 PEGs 进行突变并没有明显效果，这使得 ded1 成为理解亲缘冲突理论的关键。当 ded1 来自父系时，它可以完全支持胚胎的发育和正常的种子重量。而当它来自母系时，尽管可以确保种子的发育，但种子的重量会减轻。这一发现说明了基因的亲源特性如何影响种子的营养摄取和储备积累。

22.  在分子层面，DED1是一个转录因子，以剂量敏感的方式调控早期胚乳基因的表达。因此，该研究在鉴定DEGs（差异表达基因）和直接目标基因上有其局限性。通过比较纯合突变体和具有三种正常Ded1等位基因剂量的正常组织池，从12 DAP的胚乳组织中鉴定出了DEGs。正常的RNA提取中的这些混合胚乳基因型，以及在Ded1达到最大表达量之后的6 DAP时的采样，可能降低了检测DEGs的统计能力。此外，稳定状态的转录物水平结合了对DED1蛋白的直接转录响应和导致间接转录物水平变化的反馈机制。

    作为一个数量性的PEG（父源表达基因），Ded1也从母系遗传的等位基因中得到表达，只有纯合的突变ded1种子会中止发育。仅从母本继承功能性的Ded1等位基因会干扰一部分激活和抑制的基因，即使一个基因是通过ded1间接调控的。相比之下，Ded1的父系表达通常足以达到接近正常的稳定状态转录物水平，无论是对于直接还是间接的目标基因。至少，父源的Ded1是实现完整种子大小所必需的，如果母本等位基因有缺陷，它则变得至关重要。因此，ded1是Wilhelm Focke在1881年设想的xenia父系客体-礼物的一个例子。

    简化总结：

    DED1作为一个转录因子，在早期胚乳的基因表达中起到关键作用，其作用呈现剂量敏感性。在对比分析中，由于采样的限制和技术局限，可能降低了检测到DEGs的能力。DED1不仅仅受到父源影响，当从母本那里只继承有功能的Ded1时，它也会影响某些基因，尽管它们可能是间接受到ded1调控的。父系的Ded1至关重要，尤其是在母本等位基因出现问题时。DED1实质上是一个代表了早期生物学家对种子发育的认识的关键基因。

23.  Ded1及其直接目标的表达模式暗示了由DED1调控的发育机制 (如图4b所示)。早期的胚乳经历快速的核分裂，在共生体中进行，随后进行细胞化和额外的细胞增殖。从6到12 DAP，胚乳细胞类型被确定并分化。Ded1和许多DED1激活的目标在6-8 DAP显示出峰值表达，预测其在胚乳增殖中的功能，如cyc8，以及细胞类型分化，如fl3和ms8。晚期胚乳分化基因，如c1, pl1和se1，在ded1突变体中过早地表达，支持其在与粮食充填相关的延迟分化中的作用。像Ded1这样促进胚乳生长的PEG是Haig和Westoby提出的亲子冲突理论的直接预测。

    在13 DAP，Ded1和许多被激活的目标限制在EAS，暗示其在胚乳和胚胎之间的界面上的作用。尽管Ded1不在胚胎中表达，并且ded1突变胚胎可以完成一个完整的生命周期，但大多数ded1突变胚胎在前过渡阶段停滞。根据以前的研究，我们推测ded1在ESR或EAS细胞中的缺陷会破坏胚胎发育，而BETL的缺陷不太可能导致胚胎停止发育。BETL的发育缺陷可以由多种间接原因引起，如在参考文献53中讨论的种子汇流强度减少。此外，meg1或sweet4c中导致BETL发育主要缺陷的遗传变异不会导致胚胎发育缺陷。在ESR和EAS中的激活的DED1直接目标，包括sweet14a、sweet14b和sweet15a，支持其在促进胚乳向发育中的胚胎运输营养物质中的直接作用。相比之下，BETL特异性的sweet4c没有DED1结合位点，而sweet4c的表达被推断在ded1-ref中通过间接机制减少。

    简化总结：

    Ded1及其直接目标的表达模式揭示了由DED1调控的特定发育机制。这些机制涉及早期胚乳的细胞化、分化和增殖。Ded1及其激活的目标基因在胚乳发育的特定阶段显示出峰值表达，与胚乳的特定功能相关。特别是，这些基因在胚乳向胚胎提供营养的过程中发挥作用。尽管有些基因在Ded1的缺失下过早地表达，但它们仍在支持胚乳的发育中发挥重要作用。总的来说，这些发现为理解胚乳发育的分子机制提供了宝贵的见解。

24. 我们的数据支持一个模型，其中DED1是种子发育的中心调控因子，但被子植物在胚乳发育进程中显示出大的变异。在被子植物中印迹基因表达的低保守性使得DED1可能只在禾本科植物中显示出xenia效应。对DED1在拟南芥和禾本科物种中同源基因的蛋白序列比对揭示了主要在DNA-BD上的保守性，并有一个禾本科特异的C端域（补充图9）。与之最为接近的拟南芥基因是MYB119，并在雌配子体中具有必要的发育功能。拟南芥和玉米的DED1同源基因已经发散，但转录因子系谱在生殖发育中保持了基本功能。

    在二倍体杂交中，尚未确定有影响种子发育的拟南芥PEGs。但是，几个PEG位点在阻止2n × 4n杂交中起作用。此外，冗余的MADS-box转录因子位点phe1和phe2也可以恢复2n × 4n的种子发育。尽管phe2是双亲表达的，但phe1是一个PEG，当通过花粉遗传时，双突变能够抑制不同倍性种子的堕胎。PHE1的目标基因与DED1的目标基因具有重叠的发育功能，如偏好调节PEGs、表观遗传调控因子、生长素生物合成基因和非印迹转录因子。可能在拟南芥中的其他PEGs具有类似于ded1的xenia功能。

    总之，我们的工作确定了一个主要的种子大小的转录调控因子，它在胚乳细胞增殖、胚乳分化过程中起关键作用，并促进胚胎发育。Ded1的印迹基因表达赋予父本对正常发育和资源分配到种子的控制。这些结果支持印迹基因表达的亲缘理论和在被子植物生殖发育中的xenia关系的存在。

    简化总结：

    我们的研究发现DED1是控制种子发育的核心因子。尽管在被子植物中，胚乳的发育表现出巨大的差异，但DED1在禾本科中可能显示出特定的xenia效应。研究还发现拟南芥中的其他基因可能具有与DED1相似的功能。总体而言，Ded1在种子的胚乳细胞增殖和胚胎发育中起到关键作用，并通过印迹表达受到父本的控制，这支持了印迹基因表达的进化的亲缘理论。

25. 方法

    遗传资源

    玉米在佛罗里达大学植物科学研究和教育单位的田地中种植，或在佛罗里达州盖恩斯维尔的园艺科学系的温室中种植。ded1-ref等位基因是在对来自UniformMu种群的1068个独立种子突变体进行定量筛选中确定的。对于每个突变体，从M3分离的玉米穗上选择大约60个正常的玉米粒。测量每个玉米粒的重量，并使用定制的粮食分析器收集单粒近红外反射光谱。通过三名研究人员使用累积分布图在随机顺序中筛选每个M3玉米穗的重量来检测明显的重量簇。当2/3的研究人员评估某个玉米穗有多个玉米粒重量等级时，从可能的剂量效应突变体中称重96个正常的玉米粒，并索引选择最重的20个和最轻的20个玉米粒。这些玉米粒选择分别种植在不同的培养物中，自交，并交叉至颜色转换的W22自交植株。这个M4代的自交被评分为缺陷的玉米粒表型，而重玉米和轻玉米选择中的M4杂合子的频率使用Fisher's Exact Test进行了畸变测试。杂合的ded1-ref植株被交叉到B73和Mo17。F1交叉用于产生F2群体，并将ded1-ref回交到B73和Mo17。

    通过十个独立的CRISPR/Cas9编辑构建事件，从与HiII基因型使用农杆菌进行的交叉中分离出基因组编辑的ded1等位基因，这在爱荷华州立大学植物转化设施中进行。T0植株进行自交，并与W22、B73和Mo17自交植株交叉。F1转基因植株使用2%的草甘膦铵选择，自交以筛选缺陷的玉米粒表型，并回交到经常的自交亲本。从分离出的种子表型的单个系中放大和测序了ded1基因座。选择了四个Cas9诱导的插入-缺失突变型的ded1的非转基因分离子进行了与ded1-ref的互补试验，并进一步导入到自交系中。

26. ded1-ref的分子克隆

    使用来自B73 × ded1-ref/+ F2定位群体的100个纯合子突变型玉米粒的混合后代分析法来定位ded1-ref等位基因。从混合的玉米粒中提取DNA，并使用129个单核苷酸多态性标记在爱荷华州立大学基因组技术设施的Sequenom MassARRAY平台上进行基因型鉴定，如前所述。每个标记的W22等位基因的丰度计算为一个比例的比例，其中分子是BSA样本的W22/B73信号的比例，而分母是来自非分离的混合样本的W22和B73信号的比例。为了减少比值计算中的噪音，所有小于一的分母值都被替换为一。通过观察W22富集图确定了地图位置。图中的标记位置取自Intermated B73xMo17遗传图(https://www.maizegdb.org/data_center/map)。使用简单重复序列标记：phi037、umc1955和bnlg1671确认了染色体1的地图位置。通过使用显示在补充图2和补充表1中的七个InDel标记对来自Mo17 × ded1-ref/+交叉的362个F2和70个BC1S1单独的突变核进行基因型鉴定完成了精细定位。

    通过放大细图区间内的ded1突变体中的基因组片段，发现了ded1-ref等位基因多态性。用引物Ded-30-F5和MYB73-RT-R4扩增了W22 Ded1等位基因。ded1-ref等位基因用MYB73-F6-A和MYB73-RT-R4引物扩增。将PCR产物克隆到TOPO Blunt DNA克隆载体(Invitrogen)中并进行测序。

    通过将合成的导向RNA序列：5′-GCGCTGATCAAGGCGCACAAGCGG-3′和5′-ACCACTGGAACGCCACCAAGCGG-3′克隆到ISU玉米CRISPR克隆和转化系统中，按照描述生成了其他的ded1突变等位基因。使用十个转化的愈伤组织系再生出65个植株，这些植株在温室中通过自交和交叉到B73自交或ded1-ref/+植株进行繁殖。选择未能互补ded1-ref/+的CRISPR线进行进一步分析。通过对抗草甘膦铵的敏感性以及与ded1-ref/+植株的互补试验从T2或BC1S1植株中鉴定出CRISPR诱导的ded1等位基因的非转基因分离子。使用纯合子突变种子的DNA扩增和测序ded1基因座，以鉴定四个插入-缺失等位基因进行分析。

27. 研究内容总结： 研究探讨了玉米中的一个基因，DED1，及其对种子发育的重要性。DED1在某些作物中表现出“异质性效应”（xenia effects）。该基因的同源基因在拟南芥中被识别为MYB119，而DED1本身在玉米和拟南芥之间有所不同，但都在生殖发育中扮演了关键角色。研究还深入探讨了DED1在种子大小、胚胎发育和资源分配中的作用。

    方法总结： 玉米在不同的环境中进行培育和生长。通过筛选，确定了ded1-ref为一个显著影响种子重量的突变。该基因的位置是通过一系列复杂的分子生物学技术，如bulk segregant analysis（BSA）和single nucleotide polymorphism（SNP）分析，确定的。利用CRISPR/Cas9技术在玉米中制备了更多的ded1突变体。通过PCR技术并利用TOPO克隆策略，进一步确定了ded1-ref的位置和特性。

28. 使用MYB73-F15和MYB73-RT-R4引物确认了Ded1基因模型。根据制造商的说明，使用3'-full RACE核心套件（Takara Bio）扩增了ded1-ref突变体转录本的3'端。简而言之，从12 DAP W22和ded1-ref纯合突变子胚乳中提取的1微克总RNA进行了逆转录，使用oligo dt-3′位点接头引物，并将稀释的cDNA（1:50）与MYB73-F6-A和3'位点接头引物进行PCR扩增。

    使用StepOnePlus实时PCR机器（Applied Biosystems）并使用1×SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）执行了定量RT-PCR（qRT-PCR）。使用对比循环阈值（ΔΔCt）方法，相对于18 S rRNA进行了标准化。引物在补充表1中列出。

    使用基于W22等位基因特有的AluI限制位点的CAPS标记检测了W22和Mo17 Ded1等位基因的等位基因特异性表达。使用MYB73-CAPS-L1和MYB73-CAPS-R1引物扩增了Ded1 cDNA，并在37°C下使用20 U AluI消化了25μL PCR产物4小时，然后进行了凝胶电泳。

    总结：该研究验证了Ded1基因模型，并采用了RACE技术来扩增ded1-ref突变体的转录本的3'端。研究还通过定量RT-PCR对特定基因进行了表达分析，并使用特定的CAPS标记检测了两种Ded1等位基因的特异性表达。使用PCR产物进行消化和凝胶电泳以检测特定的限制位点。

29. 单粒重量剂量分析

    通过W22与ded1-ref/+、Mo17与ded1-ref/+、以及W22与ded1-4/+之间的互为亲本的杂交，产生了按1:1分离出同型正常和ded1杂合子的穗。对于每个穗，从中部区域抽取了96粒，以避免穗的顶部和底部。使用单粒谷物分析仪对这些谷粒进行称重，并在48孔微孔板中进行索引。使用引物MYB73-F6-A、MYB73-R5和特异的逆转录病毒LTR-F2进行ded1-ref等位基因的基因分型。通过使用引物DED1-30-F5和MYB73-R9以及随后使用限制性酶StyI消化进行ded1-4等位基因的CAPS标记基因分型。

    总结： 进行了对单个玉米粒的重量剂量分析。通过几次杂交，从玉米穗的中部区域选择了特定数量的粒子，并使用单粒谷物分析仪进行称重。然后，使用特定的引物进行基因分型，识别特定的突变型等位基因。

30. 亚细胞定位

    利用引物GFP-6、GFP-7、73ORF-F4和73ORF-R4扩增了GFP和DED1的开放阅读框(ORFs)。得到的片段使用In-Fusion（Takara Bio）克隆到pUB-iGUSPlus (Addgene)的BamHI/BstEII和BamHI位点中，分别生成pUbiGFP-DED1。作为一个核定位标记，SV40 (MPKKKRKV) NLS被通过使用引物组RFP-F1和RFP-R2通过PCR扩增与RFP的N端结合。NLS-RFP的融合片段使用引物RFP-F2和RFP-R2扩增，并克隆到pUB-iGUSPlus的BamHI/BstEII位点中，生成pUbiNLS-RFP。如前文描述60所述，GFP-DED1和NLS-RFP在玉米叶肉原生质体中瞬时表达。简而言之，玉米幼苗在暗处的生长室中生长7-10天。叶片组织被切成条状，并在28°C、暗处用1.5% (w/v) cellulose R10、0.4% (w/v) macerozyme R10、20mM MES (pH 5.7)、0.4Mmannitol、20mMKCl和0.1% (w/v) BSA进行消化3-4小时。释放的原生质体在2mM MES (pH 5.7)、154mM NaCl、125mM CaCl2和5mM KCl中洗涤，然后在4mM MES (pH 5.7)、0.4M mannitol和15mM MgCl2中重新悬浮。原生质体在40% (w/v) PEG-4000、0.2M mannitol、100mM CaCl2中进行转染。瞬时转化后12-16小时，使用旋转盘共聚焦显微镜(X81-DSU; Olympus)成像荧光。

    总结： 该研究描述了如何确定DED1蛋白在细胞内的位置。通过利用特定的克隆技术，研究人员制备了标签为GFP的DED1和标签为RFP的核定位信号。这些标签的蛋白质被瞬时地在玉米叶肉原生质体中表达，然后使用共聚焦显微镜进行观察。

31.  酵母转录激活实验

    使用Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System (Clontech)中的自动激活实验来测试转录激活。从DED1 cDNA中扩增DED1及其截断形式的开放阅读框(ORFs)，使用三种不同的正向引物(DED1-BD-F1至F3)和四种逆向引物(DED1-BD-R1至R4)组合，这些引物在补充图5b中描述，并在补充表1中列出。每一个产品都被亚克隆到带有GAL4 DNA BD的酵母表达质粒pGBKT7中。ZmICEa的ORF作为一个RT-PCR产品从12DAP B73种子RNA中扩增，并克隆到pGBKT7中。在酵母菌株AH109中测试自动激活，并根据转化酵母在SD/-Trp -His -Ade板上的生长情况进行评分。

    总结： 该研究描述了使用酵母双杂交系统进行转录激活的实验方法。利用特定的引物，从DED1 cDNA中扩增出DED1和其截断形式，然后将这些扩增产物克隆到pGBKT7酵母表达质粒中。此外，从B73种子RNA中还扩增了ZmICEa的ORF并克隆到相同的质粒中。之后，使用特定的酵母菌株进行自动激活测试，并根据酵母的生长情况进行评价。

32.  

    DED1的直接目标鉴定

    对于RNA-测序，从四个自花授粉的植物中解剖出的正常和ded1-ref同胞12 DAP胚乳组织被冷冻在液氮中。从配对的ded1-ref和正常同胞样本的每一个生物重复试验中提取总RNA。如前文所述58，使用TruSeq (Illumina)构建cDNA文库并处理原始的RNA-seq数据。简要地说，1μg的总RNA被输入到非链特异性的TruSeq (Illumina) cDNA文库中，中值插入长度为200bp。使用Cutadapt v1.1进行原始RNA-seq数据筛选以去除适配器序列，参数为：error rate=0.1, times=1, overlap=5, minimum length=0。使用以下参数修剪适配器序列，并使用Trimmomatic v0.22进行质量修剪：HEADCROP:0, LEADING:3, TRAILING:3, SLIDINGWINDOW:4:15, MINLEN:40，截断读取的碱基质量<15在4个碱基窗口内，修剪后只保留≥40个碱基的读取。使用以下参数将读取唯一对齐到B73 RefGen_v3玉米基因组组装：orientation=FR, batch=5, suboptimal levels=0, novel splicing=1, local-splice dist=8000, local-splice penalty=0, distant-splice penalty=4, quality protocol=sanger, npaths=1, quiet-if-excessive–max-mismatches=0.02, no fails-format=sam, sam-multiple-primaries–pairmax-rna=8000, pair expect=200, pair dev=150, nthreads=4。使用DESeq2 Bioconductor包检测差异表达的转录本61。如果在至少一个基因型中检测到>1的转录本，转录本被认为是表达的，共有16,219个基因模型满足这一标准。DEGs需要调整p<0.05并且Log2(倍数变化)>2。使用agriGO v2.0和默认参数分析GO术语富集62。

    对于DAP-seq，按照已建立的协议20准备玉米B73基因组DNA适配器连接库。简要地说，从正在发育的B73玉米耳(约1cm)准备的5μg的酚:氯仿:异戊醇制备的基因组DNA在EB (10mM Tris-HCl, pH 8.5)中稀释，并使用Covaris S2超声波器声波到200-bp片段。使用2:1的珠子到DNA比率纯化DNA。使用End-It kit (Lucigen)修复样品末端，使用Qiaquick PCR纯化(Qiagen) kit处理，然后在室温下使用Klenow片段(3'→5' exo-) A-tailed 30分钟。然后使用Qiaquick PCR纯化kit处理样品，并如前所述20与截断的Illumina Y-适配器结合过夜。使用1:1的珠子:DNA比率进行文库纯化，从珠子中在30μL的EB中洗脱，并使用Qubit HS荧光测定法进行定量。

    总结： 这部分描述了如何鉴定DED1的直接目标。通过对12 DAP胚乳组织进行RNA测序和后续的数据处理，筛选出了差异表达的基因。另外，还采用了DAP-seq技术来准备玉米B73基因组的DNA文库。这些方法允许研究者准确地鉴定与DED1相关的目标基因。

33. DED1 开放阅读框 (ORF) 被克隆到 pIX-HALO 质粒中，使用TNT兔网状细胞表达系统 (Promega)20 表达了HALO-DED1融合蛋白。作为阴性对照，HALO-GST并行表达。蛋白纯化和DAP-seq测定如之前所述63进行。简而言之，1μg的pIX-HALO-DED1或HALO-GST质粒DNA在30°C下在50μL兔网状细胞TNT表达反应中表达2小时。将TNT反应加入10μL冲洗过的Magne-HALO珠子 (Promega) 和40μL的1×磷酸盐缓冲盐水，加0.005% NP-40 (1xPBS +NP40)，并在室温下用管子旋转器混合1小时。随后将与蛋白结合的珠子洗涤四次，并用含1μg玉米B73适配器连接的文库的1×PBS +NP40重悬浮在100μL中。样品在室温下与管旋转器混合1小时。然后样品在1×PBS +NP40中洗涤8-10次。最后一次洗涤后，珠子在30μL的EB中重新悬浮，于98°C孵育10分钟，然后放在冰上。将样品放在磁铁上分离珠子，用移液器移除含DNA的溶液。在Illumina NextSeq500上进行75bp单读测序前，添加了DNA富集和索引适配器。DAP-seq读取被修剪64并使用bowtie2 v2.2.85365与默认参数映射到B73_v3参考基因组。仅保留独特映射的读取进行进一步分析。使用GEMv2.566调用峰值，使用Benjamini-Hochberg调整的p值 (q值) 阈值 q = 0.00001 (选项—q 5)，同时排除了来自Galli等人63的常见假阳性位点列表。额外的背景减少使用在HALO-GST体外表达的蛋白样品中识别的位点。使用GEM完成了Motif富集分析，参数为—k_min 6—k_max 20。使用MotifStack67生成Motif标志。在综合基因组查看器68中使用Bigwig文件可视化峰值。从已发布的补充文件15,25,26中下载了公开的玉米胚乳转录组分析。FPKM转录水平转化为每百万转录本 (TPM)。使用Morpheus工具 (https://software.broadinstitute.org/morpheus) 对直接目标基因进行聚类，参数为：度量 = "1-皮尔逊相关性"，连接方法 = "完全"，并按基因"行"聚类。热图使用相对于每个基因的颜色方案可视化，以示出该基因的峰值表达。

    总结:

    这部分描述了如何克隆和表达DED1的ORF，并进行DAP-seq实验以鉴定与DED1相关的DNA靶点。此外，还介绍了如何处理和分析DAP-seq数据，以及如何与公开的玉米胚乳转录组数据进行比较和整合。

34. 电泳迁移率变化分析 (EMSA)

    DED1 的开放阅读框 (ORF) 被克隆到 pGEX-4T-1 (Clontech) 中，用于在大肠杆菌菌株 BL21 中表达 GST-DED1 融合蛋白。使用 MagneGST 蛋白纯化系统 (Promega) 对融合蛋白进行纯化。从 fl3, sus1, c1 和 vp1 启动子中合成并标记了包含预测的 DED1 结合位点的寡核苷酸探针，标记使用 Pierce Biotin 3′ End DNA 标记套件 (Genewiz) 完成。标记的单链寡核苷酸与未标记的反互补寡核苷酸退火。探针序列列在补充表1中。

    蛋白-DNA结合反应包括50ng纯化的DED1-GST、6ng生物素标记的退火寡核苷酸，在20μL的10mM Tris (pH 7.5)、50mM KCl、1mM DTT、2.5% (v/v) 甘油、5mM MgCl2、50μg/μL poly(dI-dC) 和 0.05% (v/v) NP-40 中。反应在 25°C 下孵育 20 分钟，通过6% (w/v) 聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到 Hybond N+ 尼龙膜上 (Amersham Pharmacia Biotech)。使用 LightShift 荧光发光 EMSA 套件 (Thermo Fisher Scientific) 检测生物素标记的 DNA，并使用 Amersham Imager600 进行成像。

    总结:

    本节描述了如何利用电泳迁移率变化分析 (EMSA) 来检测 DED1 蛋白与 DNA 之间的结合。首先，制备和纯化 GST-DED1 融合蛋白，然后合成生物素标记的 DNA 探针。最后，执行蛋白-DNA结合反应，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析其结合，并用特定设备进行成像。

35. 组织学分析

    组织学分析是按照之前描述的方法进行的58。简要地说，收集了三个在 W22 背景下与 ded1-ref 分离的12 DAP自授粉的玉米穗。选择个别的玉米粒，手工切片，并在 3.7% 甲醛、5% 冰醋酸和 50% 乙醇中固定过夜于 4 °C。固定的组织嵌入在石蜡中，并切成8 μm厚的切片。正常胚胎切片用 safranin 和 fast green 染色，所有其他切片用基本 fuchsin 染色，然后清洗、干燥并装载。使用 Zeiss Axiophot 光学显微镜和 Amscope 数码相机完成成像。

    总结:

    本节描述了如何进行组织学分析来观察玉米粒内的细胞结构。首先，收集玉米穗并对玉米粒进行切片，然后将切片在特定的固定液中固定过夜。随后，这些切片被嵌入石蜡中并进行薄切。为了可视化细胞结构，切片进行染色，然后使用显微镜进行观察和成像。

36. Ded1 剂量系列进行基因表达分析

    W22和ded1-ref/+植物进行自授粉并互为互反交叉。在11 DAP时，从W22自授粉的玉米穗中取出胚乳组织，以取样同源的正常、DDD基因型。从ded1-ref/+自授粉中剖出同源的ded1突变体(ddd)胚乳。通过剖开单个胚乳并用multiplex PCR对相应的胚胎进行基因型鉴定，确定了杂合组织，使用MYB73-F6-A, MYB73-R5和LTR-F2 引物同时扩增正常和ded1-ref等位基因。独立的玉米穗被认为是生物学重复，并且从每个玉米穗的五个杂合玉米粒中提取了胚乳RNA。来自作为雌性交叉的ded1-ref/+植物的ddD剂量，而来自作为雌性交叉的ded1-ref/+的DDd剂量。定量RT-PCR (qRT-PCR) 如上所述完成。

    报道摘要

    与本文相关的自然研究报道摘要中提供了更多关于研究设计的信息。

    数据可用性

    RNA-seq 和 DAP-seq 数据可通过NCBI凭证GSE183304获得。ded1-ref突变体可以在玉米遗传合作股份中心获得。本文提供了源数据。

    总结:

    本节描述了如何通过使用不同剂量的Ded1对基因表达进行分析。对W22和ded1-ref/+植物进行自授粉和互为交叉，从中提取不同的胚乳组织进行RNA提取。利用qRT-PCR技术对这些RNA进行定量分析。此外，还提供了关于数据可用性和报道摘要的信息。

 

• Fig. 1 | Ded1是一个对于玉米粒发育必要的转录因子。 a 自授粉的玉米穗，在W22、B73和Mo17的遗传背景中显示出ded1-ref分离。箭头指向的是突变体。标尺条为1 cm。 b W22背景中的ded1-ref和正常同胞的玉米粒表型及矢状切面。标尺条为5mm。红色箭头指向胚胎，蓝色箭头指向玻璃质胚乳。 c 正常和ded1-ref的同胞植株。 d 19 DAP的自授粉正常同胞玉米穗。 e 19 DAP的纯合子ded1-ref玉米穗。 f Ded1基因的B73_v4基因组注释图。框框代表外显子，其中编码序列为黑色。黑线是内含子。橙线是用于Figs. 1h, 2a和4a的qRT-PCR产品。三角形表示ded1-ref逆转座子插入。5'转座子接合序列用蓝色突出显示。 g Ded1蛋白结构域的示意图，显示R2 (蓝色) 和 R3 (红色) MYB DNA结合结构域，核定位信号 (黄色)，和C端酸性结构域 (绿色)。三角形表示ded1-ref插入。Cas9诱导的移码突变的蛋白序列用紫红色突出显示。 h 12 DAP时，W22和纯合性ded1突变体胚乳中的ded1基因表达。相对qRT-PCR使用18S rRNA作为对照。数据为平均值 ± SD (n = 3 重复的PCR实验，从单个玉米穗的突变体胚乳样本中汇总)。字母表示来自Tukey的HSD检验的显著差异。 i 基于从ded1-ref杂合子(在W22和B73背景下)、ded1-3 (B73) 和 ded1-4 (W22) 的自授粉和互为父母交叉得到的50个纯合性突变种子的平均种子重。女性亲本列在前面。从每种遗传组合中的三个玉米穗收获的突变种子。所示数据为平均值 ± SD (n = 3个来自不同植株的生物独立的玉米穗，每个玉米穗取样50个突变核)。字母表示来自Tukey的HSD检验的显著差异。
• Fig. 2 | Ded1在胚乳中的表达和父性印迹影响玉米粒重量。 a Ded1在解剖出的W22胚乳和胚胎组织中的表达。转录水平被归一化为18 S rRNA。数据显示为平均值±SD (n=3重复的PCR实验，从单个玉米穗的组织样本中汇总)。 b 在12 DAP胚乳组织中，通过比较自交的近亲和W22与Mo17之间的三个生物重复的互为父母交叉来观察Ded1的等位基因特异性表达。母亲亲本首先列出，下面是胚乳的基因剂量。来自W22和Mo17近亲的cDNA的按比例混合以分数混合比率指示。RT-PCR产物用AluI消化以消化W22产物。 c, d 纯合正常和ded1杂合子同胞玉米粒的盒形图，分别表示ded1的母性（c）和父性（d）传输。盒子代表四分位数范围，中位数由水平线表示。须表示1.5倍的四分位数范围。点表示单个核重，异常核用星号表示。对于每个交叉，母本首先列出。纯合正常（DDD）的核在蓝色中绘制。杂合核绘制在橙色中。x轴还指示绘制的核数量和双侧学生t检验的p值，未进行多重检验校正。单个核重和描述性统计数据在源数据文件中。
• Fig. 3 | DED1目标基因的识别。 a 与注释的转录起始位点相对应的每100bp的DED1 DAP-seq峰数量。橙色线显示用于识别直接目标基因的结合启动子区域。 b 使用得分最高的5000个DAP-seq峰通过meme-chip v4.12.0识别的顶部DED1结合模式的序列徽标。 c 维恩图显示由DED1结合的基因，从TSS的-1到+0.1 kb，这些基因被测试用于鉴定差异表达（橙色），以及来自12 DAP ded1-ref和正常同胞胚乳的DEGs (q <0.05, FC> 2，以及TPM> 1)。重叠的基因（白色文本）被推断为DED1的直接目标，包括258个DED1激活和180个DED1抑制的基因。 d 在fl3处的DAP-seq读取的基因组浏览器可视化。 e 使用DED1-GST纯化蛋白和标记的fl3启动子进行的EMSA。与标记的fl3探针相比，正常（Nor）或突变（Mut）竞争探针的浓度增加了100倍。此实验完成两次，结果相似。 f 公开的玉米转录组数据，用于已知在胚乳发育中起作用的Ded1和DED1目标基因15,25,26。颜色刻度指示每个基因的相对表达水平。在8 DAP解剖组织中，se1基因座的表达未被检测到。
• Fig. 4 | DED1目标的剂量依赖性调控。 a 通过qRT-PCR在Ded1 (D) 和 ded1-ref(d)的四种剂量状态中测定正常等位基因的Ded1及DED1下游基因的表达。分析的基因包括fl3直接目标、de18潜在直接目标、sweet4c激活的DEG、tcrr1印迹的DEG、az22z5 α-玉蛋白抑制的DEG和a2抑制的DEG。数据点是三个技术重复的平均值。条形图和误差条表示三个来自独立耳朵的生物学重复的平均值±标准偏差 (n = 3)。字母表示从Tukey的HSD测试中的显著差异 (P<0.05)。 b DED1目标和下游基因座的示意图，这些基因座在胚乳发育中有记录的作用。DED1激活在胚乳发育早期和营养转移组织中起作用的基因座。DED1在谷物充填过程中晚些时候抑制基因座的活性。