摘要：
溶解曲线是做染料法定量pcr时，用到的一种结果分析方法。一般染料法定量pcr在进行完pcr后都要运行熔解曲线，一般设定先94度几分钟，然后骤冷到65度（假定65度为退伙温度）。在65度时，pcr产物是以双链的形式存在的，因为染料是插到双链dna的小沟里然后发荧光的，所以这个时候检测到很强的光信号，随 阅读全文
posted @ 2021-07-15 11:29
棋琴
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摘要：
RFU为荧光单位，随着温度的升高，荧光值一直在下降，表明DNA双链在变性成为单链，但是下降速率却是不一样的，如绿色的线大概在85°后下降变快，蓝色和红色的线却在85°前下降变快，求它的导数(-d(RFU)/dT)即为对应的下降速率，如下图： 那么，溶解峰会给我们提供什么信息呢？ 上图的三种颜色代表了 阅读全文
posted @ 2021-07-15 11:27
棋琴
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摘要：
根据SYBRGREEN原理，循环反应结束之后。通常的方式就是从70度加热到90度，然后每隔一定时间（一秒或者少一秒。不知道PCR的荧光扫描头能不能做到）来测定系统荧光强度。随着温度的升高，dsDNAi都解开双链，sybrgreen都游离之后不发荧光，荧光逐渐下降，那么就画出一个荧光强度和温度的曲线： 阅读全文
posted @ 2021-07-15 10:12
棋琴
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摘要：
扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线，随着反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50%的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体 阅读全文
posted @ 2021-07-15 09:31
棋琴
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摘要：
溶解曲线是为了验证扩增产物特异性的，要是溶解曲线是单峰说明产物只有一条，结果较好；要是双峰说明产物不特异，可能存在引物二聚体或非特异性扩增，有可能引物设计有问题。 阅读全文
posted @ 2021-07-15 09:23
棋琴
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摘要：
总的DNA双螺旋结构降解一半的温度称为熔解温度（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。 阅读全文
posted @ 2021-07-15 09:12
棋琴
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