大豆GmANKTM家族非生物胁迫生物信息学分析

大豆GmANKTM家族非生物胁迫生物信息学分析

唐明杰，黄铄婷，洪一帆，周文财

1.简介

ANK基序在Swi6/Cdc10蛋白和果蝇信号蛋白中被首次发现。ANK基序主要功能是介导蛋白与蛋白间的相互作用。ANK基序可与其他结构域（跨膜结构域、锌指结构域、SBP结构域、BTB结构域等）组合形成Ankyrinrepeats（ANK）蛋白超家族，其中ANK基序与跨膜结构域组合形成ANKTM（Ankyrinrepeatstransmembrane）蛋白，为含ANK基序和跨膜结构域的蛋白。ANKTM蛋白在细胞膜信号传导中发挥作用。

ANKTM家族基因具有降低非生物胁迫下植物损伤功能。拟南芥ANKTM家族成员ITN1在盐胁迫下表达量上升，通过抑制ABA信号通路中产生活性氧基因，减少活性氧物质积累，降低盐胁迫对植物损伤。拟南芥中ACD6基因编码蛋白含9个锚蛋白单元和5个跨膜结构域，影响和调节拟南芥防卫反应的SA信号途径。ANKTM家族基因在植物抗病过程中也发挥作用，拟南芥BDA1基因是一个与植物体抗病有关的位点，该位点抑制突变体，出现防御反应减少，易感染病菌现象。ANKTM家族基因具有诱导细胞提前衰老的功能。大豆中IGN1基因包括7个ANK基序和4个跨膜结构域，研究者发现该基因过表达致使植株细胞提前衰老。

2.材料与方法

2.1大豆GmANKTM家族基因筛选与鉴定分析

网站或软件	网址或方法	目的
SMART	http://smart.embl-heidelberg.de/	检索大豆ANK基因 分析基因结构域组成
TMHMM	http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/	跨膜结构域分析
MEGA（V7.0.20）	Neighbor-joining（NJ）法、ClustalX比对	构建Noofbootstrapreplicationswere1000
ExPASy	http://www.expasy.org/tools/	计算等电点
PLANTCARE	http://bioinfor⁃matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/	分析基因上游1500bp序列

2.2GmANKTM家族基因表达特性分析

数据库或软件	网址或方法	目的
phytozome	https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#	分析9个组织中大豆GmANKTM家族基因表达情况
GEO	https://www.nc⁃bi.nlm.nih.gov/geo/	分析基因不同胁迫下表达变化
TBtools	AmazingHeat⁃map	绘制表达量数据热图

2.3大豆材料处理

将大豆种子（GlycinemaxcvDongnong50）放置于浸湿双层滤纸中，室温（25℃）下浸润2d发芽。将发芽幼苗转移到蛭石培养容器中，浇灌霍格兰培养液培养（pH5.8）2周。当幼苗第2片3出复叶展开时，将其转移到霍格兰培养液中。幼苗适应环境后开始盐胁迫处理：使用150mmol·L-1NaCl溶液浸没大豆幼苗根部。处理后分别在0、0.5、1、3、6、12h，共6个时点取叶片为样品。每个时点3次生物学重复，将所有样品放入液氮中，-80℃保存待用。

2.4RNA提取和实时荧光定量PCR

使用UltrapureRNA试剂盒（CWBIO，China）提取叶片RNA。

除去基因组DNA后，使用TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix（TRANSGENBIO，China）获得第一链cDNA。

使用TransStartTopGreenqPCRSuperMix（TRANSGENBIO，China）实时定量PCR（qRT-PCR），ABI7300实时定量PCR系统（AppliedBiosystems，USA）开展试验。

使用NCBI引物设计网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/），依据GmANKTM3、GmANKTM16、GmANKTM19、GmANKTM36和GmANKTM49。

扩增条件为：将15μL反应体系加热到95℃2min，然后以95℃5s，60℃15s，72℃10s为一个循环，共40个循环。

3.结果分析

3.1大豆ANKTM家族成员鉴定和分类

从大豆中鉴定出62个GmANKTM家族基因，命名为GmANKTM1-GmANKTM62，根据进化关系及结构域相近度将其划分为5个亚家族。

GmANKTM家族基因编码蛋白含346~1039个氨基酸，预测分子质量为37.88~114.83ku，等电点（pI）为4.46~9.61。大豆ANKTM家族蛋白包含1~9个ANK基序和1~2个C末端跨膜结构域。GmANKTM家族基因含ANK基序数量不等且位置有差异。除GmANKTM57和GmANKTM58外，其余基因跨膜结构域均位于C末端。除ANK结构域和跨膜结构域外，还有6种结构域。53个成员含PGG结构域、4个成员含SBP结构域、3个成员含锌指结构域、2个成员含DUF4219结构域、1个成员含有G-PCR结构域、1个成员含有ACBP结构域、1个成员含有cNMP结构域、1个成员含Irontrans结构域。GmANKTM家族基因最少含3种结构域，最多含4种结构域。同一亚家族中蛋白结构域分布位置和种类相近。除ANK基序、跨膜结构域和PGG结构域外其余结构域大部分集中在第5亚家族，第2亚家族有少量分布。这些不同结构域赋予ANKTM家族蛋白特异性结合不同底物蛋白质的能力，使基因功能具有多样性。

3.2大豆ANKTM基因启动子元件分析

在大豆ANKTM家族基因启动子中，光响应相关元件数量最多。GmANKTM44基因含光反应相关元件数量最多，为23个（Box4、G-Box、ACE、ACTA-motif等）；其次是GmANKTM39基因含20个光反应相关元件，GmANKTM54基因含18个光反应元件。

GmANKTM家族中光反应相关元件数量较多，说明这些基因可能响应光强、光周期变化或与光形态发生有关。GmANKTM家族成员还有许多与逆境和激素相关元件，如GmANKTM60基因含16个激素响应相关元件（ABRE、CGTCA-motif、TGACG-motif等）；GmANKTM26基因含14个激素相关元件。说明这些基因可响应乙烯、水杨酸、脱落酸、茉莉酸乙酯等激素。

3.3大豆ANKTM家族基因组织表达分析

GmANKTM基因5个亚家族，每个亚家族基因表达模式较相似。

第1亚家族中GmANKTM4基因在叶、根瘤及茎尖中表达量最高。

第2亚家族基因在各组织中表达有差异，如GmANKTM12基因在茎尖中表达量最高，种子中表达量较低。GmANKTM19基因在叶片中表达量最高，种子中表达量较低。

第3亚家族基因在不同组织中表达量与其他亚家族相比较低。仅GmANKTM33基因在叶片中表达量与其他亚家族基因相比较高。

第4亚家族基因在各组织中表达量相近，各基因间表达程度相近。仅GmANKTM46、GmANKTM49和GmANKTM53基因表达量相对同亚家族表达量低。

第5亚家族基因与其他亚家族相比表达量较高。

3.4大豆ANKTM家族基因非生物胁迫响应分析

GmANKTM家族在受盐胁迫处理后47个基因表达量上升，12个基因表达量下降，3个基因表达量无变化，GmANKTM18、GmANKTM19、GmANKTM20、GmANKTM26、GmANKTM33、GmANKTM37、GmANKTM53、GmANKTM55基因表达量大幅上升。

干旱胁迫下，45个基因表达量上升，13个基因表达量下降，4个基因表达量无变化，GmANKTM6、GmANKTM7、GmANKTM13、GmANKTM15、GmANKTM37、GmANKTM38基因表达量上升较高，但小于盐胁迫上升量。

qPCR验证GmANKTM家族基因盐胁迫下表达状况。选择GmANKTM3、GmANKTM16、GmANKTM19、GmANKTM36、GmANKTM49基因验证其盐胁迫下表达趋势。其中，GmANKTM16、GmANKTM19、GmANKTM36基因启动子区域含胁迫响应元件（LTR、MBS、WUN-motif、MBS），GmANKTM3、GmANKTM49基因启动子区域不含胁迫响应元件。5个基因盐处理下实时定量分析数据与高通量数据表达趋势比较。150mmol·L^-1NaCl溶液处理后，含胁迫响应元件的GmANKTM16和GmANKTM36基因呈上升趋势；GmANKTM19基因表达量持续上升，与RNA-seq数据先升后降模式不同，但两者整体呈上升趋势。不含胁迫响应元件的GmANKTM3、GmANKTM49基因表达量呈下降趋势。发现这5个基因表达量变化均与RNA-seq数据变化一致。说明GmANKTM16、GmANKTM19、GmANKTM36基因确实受盐胁迫诱导表达，且与胁迫应答元件相关。

4.讨论与结论

拟南芥基因组中共鉴定出40种编码AtANKTM家族基因的蛋白，少于大豆中GmANKTM家族基因数量，且拟南芥ANKTM家族基因含4~5个ANK基序，大豆GmANKTM家族基因最多含9个ANK基序。GmANKTM家族蛋白含数量不等的ANK基序和跨膜结构域。此外，还有6种其他结构域，与ANK和跨膜结构域共同形成GmANKTM家族。相同家族大豆GmANKTM家族62个基因编码蛋白含346~1039个氨基酸，分子质量为37.88~114.83ku，等电点（pI）4.46~9.61。

顺式元件种类和数量侧面表征基因作用和功能。GmANKTM家族成员含3~28个光反应元件，最多含16个激素相关反应元件、4个逆境胁迫相关反应元件。不同亚家族成员含元件种类和数量不同。顺式作用元件不同环境信号刺激下诱导某些与胁迫相关基因表达。GmANKTM家族基因启动子区域分析发现，46个基因含响应不同非生物胁迫的作用元件，同时还含多种激素反应相关元件。顺式作用元件种类繁多，说明这些基因功能复杂多样，可能参与植物对胁迫响应应答。激素参与多种植物响应胁迫通路中，说明GmANKTM家族基因可能参与植物胁迫应答。胁迫出现时通过正调控或负调控方式参与逆境胁迫。其中，GmANKTM52基因含GC-motif和WUN-motif两种与胁迫相关的元件。GmANKTM52基因含非选择性的CNG离子通道，通过调节离子平衡响应胁迫，与结果相符。

通过组织或器官中特异性基因表达量调控植物大部分生长和发育过程。本研究分析GmANKTM家族基因在大豆9个不同组织中表达模式，发现同一亚家族基因在不同大豆组织中表达模式相近，但不同亚家族间表达量不同，发现第4、5亚家族基因表达量明显高于其他亚家族基因。第5亚家族基因各组织表达量较高，说明其可能是泛表达基因，在大豆全生命过程均发挥作用。不同组织间比较发现，GmANKTM家族基因更倾向于叶片中表达，种子中表达量较小。拟南芥中发现AtANKTM家族基因同样趋向于叶片中表达。以上结果说明，GmANKTM家族不同组织中以不同亚家族为单位，特异性表达，不同亚家族基因间存在功能差异，可能参与特定部位或阶段发育过程。

ANKTM家族是一个功能多样的基因家族。研究发现，受盐胁迫和干旱胁迫处理后，GmANKTM家族基因表达量发生显著变化。说明GmANKTM家族基因可能参与盐胁迫和干旱胁迫响应。GmANKTM60基因含SBP结构域，研究表明含SBP结构域基因与热激效应和抗逆境胁迫相关。本研究发现GmANKTM60基因受盐胁迫和干旱胁迫强烈诱导，与前人研究一致。而拟南芥AtANKTM家族基因ACD6与逆境胁迫中的水杨酸信号转导有关。选取5个基因验证其表达量变化，发现GmANKTM3、GmANKTM16、GmANKTM19、GmANKTM36和GmANKTM49基因盐胁迫处理下表达趋势与RNA-seq数据变化趋势相同。其中含胁迫响应元件GmANKTM16（LTR、MBS）、GmANKTM19（LTR、WUN-motif）和GmANKTM36（MBS）基因表达量上升，不含胁迫响应元件GmANKTM3、GmANKTM49基因表达量下降。启动子区域是基因转录的起始位置，其中包含的作用元件可体现基因潜在功能。说明GmANKTM家族成员表达量升降现象可能与启动子区域胁迫响应元件相关。