FANS（Fluorescence-Activated Nuclei Sorting，荧光激活核分选）是一种基于流式细胞术（Flow Cytometry）原理，专门用于细胞核而非整个细胞的分选技术。该方法是传统FACS（Fluorescence-Activated Cell Sorting）的一种变体，广泛应用于单核转录组（snRNA-seq）和单核染色质可及性测序（snATAC-seq）等研究中，尤其适用于对难以分离完整细胞或组织较坚硬（如心脏、脑组织、冷冻组织）的样本进行高通量核分选。
一、FANS 的基本原理
FANS 的核心是将组织样本中的细胞核释放出来，然后使用荧光染料（如 DAPI 或 Hoechst）标记这些核的 DNA，在流式细胞仪中依据荧光强度、前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）等参数，识别并分选出目标细胞核群体。
二、FANS 实验步骤详解
1. 组织裂解与核提取
- 对冷冻或新鲜组织进行机械剪碎。
- 使用温和裂解缓冲液（如NP-40或Triton X-100含有的核裂解缓冲液）裂解细胞膜，释放出细胞核，同时尽量保持核结构完整。
- 通过低速离心去除细胞碎片与细胞膜残留物，保留核团。
2. 荧光染色
- 常用的DNA染料有：
- DAPI（4′,6-diamidino-2-phenylindole）：结合双链DNA，荧光蓝光；
- Hoechst 33342：细胞通透性好，也用于标记 DNA。
- 若需分选特定类型细胞的细胞核，可引入抗体标记核内或核膜蛋白（如NeuN标记神经元核），搭配荧光标记的二抗。
3. 流式细胞仪检测与分选
- 利用流式细胞仪检测染色核的荧光强度与物理参数（FSC/SSC），去除碎片、双核、细胞残骸等。
- 根据设定门控（gating）策略，筛选出单个完整的细胞核。
- 若有标记特定亚型核（如心肌细胞 vs 间质细胞），可使用多通道荧光进一步分选。
三、FANS 的优点
| 优势 |
说明 |
| ✅ 专用于细胞核 |
适合难以获取完整细胞的组织如心脏、脑等 |
| ✅ 与冷冻组织兼容 |
冻存后细胞膜易破裂，但核结构依然完整 |
| ✅ 与多种下游分析兼容 |
如 snRNA-seq、snATAC-seq、snMultiome |
| ✅ 可高通量自动化 |
利用流式系统分选效率高、准确度高 |
四、FANS vs FACS vs INTACT
| 方法 |
样本对象 |
是否需完整细胞 |
是否高通量 |
用途 |
| FANS |
细胞核 |
❌ 不需要 |
✅ 是 |
snRNA-seq, snATAC-seq |
| FACS |
细胞 |
✅ 需要完整活细胞 |
✅ 是 |
scRNA-seq, 免疫分型 |
| INTACT |
细胞核 |
❌ 不需要 |
❌ 否（基因工程） |
表观调控研究中分选特定核 |
五、FANS 在心脏样本中的应用背景
在心脏组织等机械硬度较大的样本中，细胞完整提取困难，尤其是经过冷冻的样本。此时：
- 直接进行scRNA-seq容易造成细胞破损、低质量数据；
- 而snRNA-seq 与 snATAC-seq 更适合使用分离的细胞核，这就需要 FANS 精准地分选出完整核进行测序，提升数据质量。
一、FACS 是什么？
FACS（Fluorescence-Activated Cell Sorting） 是一种基于流式细胞术（Flow Cytometry）的高通量细胞分选技术，它不仅能检测细胞，还能将带有特定荧光特征的活细胞分选出来，广泛用于单细胞测序、免疫表型分析、干细胞富集等领域。
二、FACS 实验流程详解
1. 细胞样本制备
- 样本类型可包括血液、培养细胞、组织消化产物等。
- 固体组织如心脏、脑需先经酶消化（如胶原酶、胰酶）得到单细胞悬液。
2. 荧光标记
- 使用荧光标记的抗体识别细胞表面或胞内特异性蛋白。
- 例如：CD3（T细胞）、CD45（免疫细胞）、EpCAM（上皮细胞）。
- 可多通道同时标记 4–20 余种蛋白。
3. 流式检测与门控（Gating）
- 通过流式细胞仪测量：
- 前向散射光（FSC）：细胞大小
- 侧向散射光（SSC）：细胞内复杂度
- 荧光信号：各标记抗体发出的信号
- 根据这些信号划定不同细胞群体的门（gate）进行分析或分选。
4. 细胞分选
- 利用电荷偏转技术，将荧光标记阳性的目标细胞分选至不同收集管，实现活细胞的精准分选。
三、FACS 的特点与优势
| 特点 |
说明 |
| 🎯 目标：活细胞 |
可用于后续培养、功能实验、单细胞转录组等 |
| 🔬 可多通道分析 |
同时分析多个蛋白标记，分群精细 |
| ⚙️ 自动化、高通量 |
每秒可检测上万个细胞 |
| 🧬 下游兼容性广 |
与 scRNA-seq, TCR-seq, 单细胞蛋白组等兼容 |
| 🌡 对样本状态有要求 |
需新鲜、活性良好的单细胞悬液，组织硬或冷冻样本不适合 |
四、FACS 与 FANS 对比
| 项目 |
FACS |
FANS |
| 目标物 |
完整活细胞 |
细胞核 |
| 样本适应性 |
需活性好、可消化的细胞 |
冷冻组织、纤维化组织、高硬度器官更适合 |
| 是否保留活性 |
✅ 保留细胞活性 |
❌ 细胞核不可培养 |
| 荧光标记对象 |
细胞膜、细胞内蛋白 |
核内或核膜蛋白 / DNA 染料 |
| 典型应用 |
免疫细胞分型、干细胞筛选、scRNA-seq |
snRNA-seq、snATAC-seq、表观组学 |
| 下游技术 |
scRNA-seq、功能培养、再编程等 |
snRNA-seq、snATAC-seq、多组学 |
五、总结
| 如果你关注 |
推荐技术 |
原因 |
| 活细胞功能、培养、免疫表型 |
FACS |
保留完整细胞，可多重荧光、活细胞回收 |
| 处理冷冻/坚硬/结构复杂组织，需核信息 |
FANS |
获取高质量细胞核，适合单核组学研究 |
🧬 一、技术定义与基本流程对比
| 项目 |
scRNA-seq |
snRNA-seq |
| 全称 |
Single-cell RNA sequencing |
Single-nucleus RNA sequencing |
| 分离对象 |
整个活细胞 |
细胞核 |
| 关键技术 |
FACS、微流控（10x等） |
FANS、微流控（10x等） |
| RNA来源 |
细胞内总mRNA（核 + 胞质） |
主要为核内mRNA（前体mRNA为主） |
⚙️ 二、技术流程对比（示意）
🔹 scRNA-seq：
新鲜组织 → 酶消化 → 单细胞悬液 → FACS（可选）→ 10x微流控/Drop-seq → 文库构建 → 测序
🔹 snRNA-seq：
冷冻组织/新鲜组织 → 物理裂解 → 提取细胞核 → FANS → 10x微流控/Drop-seq → 文库构建 → 测序
🧪 三、数据层面差异
| 维度 |
scRNA-seq |
snRNA-seq |
| 检测RNA类型 |
mRNA（胞质+核） |
主要为核内mRNA（包括前体mRNA） |
| 外显子/内含子占比 |
以外显子为主 |
内含子富集（前体mRNA未剪接） |
| 基因检测数量 |
更多（信息更全） |
相对较少（但更稳定） |
| 代表性 |
某些类型易被消化丢失 |
更好地代表真实组织构成（包含不可消化细胞） |
🧩 四、适用场景差异
| 应用方向 |
推荐技术 |
理由 |
| 🫀 冷冻或高纤维组织（心脏、脑、肾） |
snRNA-seq |
不依赖完整细胞，适合冷冻样本和难解离组织 |
| 🧫 免疫细胞群体（外周血、肿瘤TME） |
scRNA-seq |
细胞易于获得，可精准标记并活性分选 |
| 🧬 转录动态、剪接变异分析 |
scRNA-seq |
捕获成熟 mRNA、细胞质含量丰富 |
| 🧠 空间分布研究（与空转数据配合） |
snRNA-seq |
空转数据常来自冷冻切片，与snRNA-seq相兼容 |
| 🧪 药物干预或诱导实验后采集新鲜细胞 |
scRNA-seq |
可结合功能实验、培养验证等 |
🔄 五、与 FACS / FANS 联合应用策略
| 测序类型 |
前处理技术 |
说明 |
| scRNA-seq |
FACS |
- 可分选活细胞亚群（如CD4+ T细胞）进行高分辨率分析 - 活细胞可培养或进一步实验验证 |
| snRNA-seq |
FANS |
- 可从冷冻组织中分选完整细胞核，获取代表性强的组织转录图谱 - 可配合DAPI/NeuN等标记分选特定核群 |
🧠 六、实际研究中的应用示例
| 示例 |
描述 |
方法 |
| 成人人心脏不同房室单核图谱 |
难以获取活细胞，且冷冻组织更易获取 |
snRNA-seq + FANS |
| 肿瘤浸润T细胞功能研究 |
需活细胞、功能验证及TCR测序 |
scRNA-seq + FACS |
| 老年脑组织阿尔兹海默分析 |
基本无活细胞，结构复杂、难解离 |
snRNA-seq + FANS |
| 肾小球单细胞谱系追踪 |
某些细胞类型解离后损失严重 |
snRNA-seq 更保守准确 |
✅ 七、总结建议
| 你关注的研究重点 |
推荐方法 |
| 获取更全面、成熟的转录本 |
scRNA-seq |
| 样本保存条件不佳或组织结构复杂（如心脏） |
snRNA-seq |
| 要进行免疫分型、功能验证、细胞培养 |
FACS + scRNA-seq |
| 要最大限度还原组织细胞组成 |
FANS + snRNA-seq |
如果你是研究 人心脏、冷冻样本、或难以解离的纤维组织（如KOA软骨），推荐使用 FANS + snRNA-seq。
如果你关注 免疫细胞亚群、疾病微环境、TCR/BCR 重构、或诱导实验后的活细胞分析，则更适合 FACS + scRNA-seq。
浙公网安备 33010602011771号