纳米抗体筛选的两大核心技术:噬菌体展示与酵母双杂交实操解析
在纳米抗体(Nb)研发流程中,“筛选” 是连接 “文库构建” 与 “功能验证” 的关键环节 —— 只有通过高效筛选技术,才能从海量随机序列中精准捕获到 “高特异性、高亲和力” 的目标纳米抗体。目前,噬菌体展示技术与酵母双杂交技术凭借成熟的操作体系、广泛的适用性,成为科研人员最常用的两大筛选手段。本文将从技术原理、实操流程、应用案例三个维度,详细拆解这两种技术的核心逻辑与实操要点,为纳米抗体筛选提供可落地的技术参考。
一、噬菌体展示技术:纳米抗体初筛的 “高效富集工具”
噬菌体展示技术自 1985 年由 Smith 等人创建以来,因 “高库容、快筛选、易操作” 的优势,成为从免疫文库中筛选抗原特异性纳米抗体的 “黄金标准”。其核心逻辑是通过将纳米抗体基因与噬菌体外壳蛋白基因融合,实现 “基因型(噬菌体 DNA)” 与 “表型(纳米抗体结合活性)” 的一一对应,再通过多轮淘选富集阳性克隆。
1. 技术原理:外壳蛋白融合介导的 “基因 - 蛋白联动”
常用的噬菌体载体为 M13 丝状噬菌体,其基因组可容纳外源 DNA 片段,且外壳蛋白(如 pIII、pVIII)的 N 端或 C 端可融合外源蛋白。在纳米抗体筛选中,通常将 VHH 基因(纳米抗体核心序列)与 M13 噬菌体的 pIII 蛋白基因融合 —— 当噬菌体复制时,纳米抗体会随 pIII 蛋白一起展示在噬菌体表面,形成 “每颗噬菌体携带一种纳米抗体变体” 的展示库。通过抗原与噬菌体表面纳米抗体的特异性结合,即可捕获目标噬菌体,进而通过测序获得对应的 VHH 基因序列。
2. 实操流程:3-5 轮淘选 + ELISA 验证,实现精准富集
噬菌体展示筛选的标准流程可分为五个关键步骤,每一步都需严格控制条件以避免假阳性或假阴性:
- 步骤 1:免疫文库构建
首先用目标抗原免疫骆驼科动物(如骆驼、羊驼)或转基因大鼠 / 小鼠(可产生人源化纳米抗体),待机体产生免疫应答后,采集外周血分离淋巴细胞;提取总 RNA 并通过逆转录合成 cDNA,再利用 VHH 基因特异性引物进行 PCR 扩增,构建 VHH 基因文库。 - 步骤 2:噬菌体展示库构建
将扩增的 VHH 基因插入 M13 噬菌体展示载体(如 pCANTAB5E),转化大肠杆菌后加入辅助噬菌体(如 M13K07)进行培养 —— 辅助噬菌体会提供噬菌体复制所需的蛋白,最终释放出表面展示纳米抗体的重组噬菌体,形成库容可达 10¹⁰-10¹² 的噬菌体展示库。 - 步骤 3:多轮固相淘选富集
采用 “固相淘选法” 进行筛选:将目标抗原通过物理吸附或化学偶联固定在载体表面(如酶标板、磁珠、抗原管),加入噬菌体展示库孵育(通常室温孵育 1-2 小时);随后用含 0.1%-0.5% Tween-20 的缓冲液(如 PBS-T)进行梯度洗涤(通常 3-5 次),洗去未结合的阴性噬菌体;最后用酸性洗脱液(如 0.1M HCl,pH2.2)或特异性竞争抗原洗脱结合的阳性噬菌体,并立即用 Tris-HCl 缓冲液中和。将洗脱的阳性噬菌体感染大肠杆菌,扩增后用于下一轮淘选,通常需重复 3-5 轮 —— 每轮淘选后,阳性噬菌体的富集倍数可达 10²-10³ 倍,逐步淘汰非特异性克隆。 - 步骤 4:ELISA 验证与测序
淘选结束后,从最后一轮扩增的菌落中随机挑选单克隆,培养后收集噬菌体上清,通过间接 ELISA 验证其与目标抗原的结合特异性(用酶标抗 M13 抗体检测结合的噬菌体);对 ELISA 阳性的克隆进行测序,即可获得目标纳米抗体的基因序列。 - 步骤 5:纳米抗体重组表达
将测序正确的 VHH 基因克隆到原核表达载体(如 pET-28a),转化大肠杆菌 BL21(DE3)后进行诱导表达,通过 Ni-NTA 亲和层析或蛋白 A/G 层析纯化纳米抗体,用于后续功能验证(如亲和力测定、中和活性检测)。
3. 应用优势与案例:缩短研发周期,提升筛选效率
噬菌体展示技术的核心优势在于 “高库容 + 快富集”—— 相比其他筛选技术,其可覆盖更多样的纳米抗体序列,且 3-5 轮淘选仅需 1-2 周即可完成,大幅缩短研发周期。例如,李光琪等人利用噬菌体展示技术构建羊驼免疫 VHH 文库,通过 3 轮淘选从文库中筛选到针对禽流感病毒 HA 蛋白的纳米抗体,ELISA 验证显示其特异性结合率达 95% 以上,且 IC₅₀值(半数抑制浓度)低至 1.2 nM,证明该技术在高亲和力纳米抗体筛选中的有效性。
二、酵母双杂交技术:基于蛋白互作的 “精准筛选工具”
酵母双杂交技术以真核酵母为宿主,通过检测蛋白质 - 蛋白质相互作用(如纳米抗体 - 抗原结合)来筛选目标克隆,其核心优势是 “真核表达环境 + 高灵敏度”,尤其适合筛选需正确折叠的构象型抗原特异性纳米抗体。
1. 技术原理:转录激活介导的 “互作检测”
酵母双杂交技术的原理基于真核生物转录因子的模块化结构 —— 转录因子通常包含 DNA 结合结构域(BD)和转录激活结构域(AD),只有当 BD 与 AD 通过 “靶蛋白 - 诱饵蛋白” 的相互作用靠近时,才能激活下游报告基因(如 β- 半乳糖苷酶基因 lacZ、组氨酸合成基因 HIS3)的表达。在纳米抗体筛选中,通常将已知抗原基因与 BD 基因融合(构建 “诱饵载体”,如 pGBKT7 - 抗原),将纳米抗体文库基因与 AD 基因融合(构建 “猎物载体”,如 pGADT7-VHH);当纳米抗体与抗原特异性结合时,BD 与 AD 会形成功能性转录因子,激活报告基因表达,通过筛选报告基因阳性的酵母克隆即可获得目标纳米抗体。
2. 实操流程:文库杂交 + 选择性筛选,捕获阳性克隆
酵母双杂交筛选的实操流程需严格控制酵母转化效率与筛选条件,具体步骤如下:
- 步骤 1:诱饵载体与文库构建
首先克隆目标抗原基因,插入酵母双杂交诱饵载体(如 pGBKT7),构建 pGBKT7 - 抗原重组载体;同时,从免疫动物外周血中提取 RNA,逆转录合成 cDNA 后扩增 VHH 基因,将其插入猎物载体(如 pGADT7),构建 VHH 酵母双杂交文库(库容通常为 10⁶-10⁸)。 - 步骤 2:酵母共转化与杂交
将诱饵载体转化至酵母感受态细胞(如 AH109),筛选出能稳定表达诱饵蛋白且无自激活活性的酵母菌株(避免诱饵蛋白单独激活报告基因);随后将 VHH 文库与诱饵菌株进行共转化或杂交(通过酵母接合生殖实现文库导入),培养后观察酵母克隆形态 —— 当文库中的纳米抗体与诱饵抗原结合时,酵母会形成典型的 “三叶草形” 杂合体。 - 步骤 3:选择性筛选与验证
将杂交后的酵母细胞涂布在含选择性培养基的平板上(如 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade,缺失色氨酸、亮氨酸、组氨酸、腺嘌呤),只有报告基因激活的阳性克隆才能在该培养基上生长;进一步通过 X-α-Gal 显色实验筛选 lacZ 基因阳性的克隆(阳性克隆会呈蓝色);挑取蓝色克隆,提取酵母质粒并转化大肠杆菌,通过测序获得 VHH 基因序列。 - 步骤 4:功能验证
将测序正确的 VHH 基因克隆到真核表达载体(如 pPICZαA),在毕赤酵母中表达纯化纳米抗体,通过 ELISA、免疫细胞化学等实验验证其与抗原的特异性结合活性及功能(如中和活性、酶活性调控)。
3. 应用案例:构象型抗原与病毒特异性纳米抗体筛选
酵母双杂交技术因真核表达环境,能确保抗原与纳米抗体的正确折叠,尤其适合筛选病毒表面构象型抗原特异性纳米抗体。例如,Gao 等人用新城疫病毒(NDV)灭活疫苗免疫双峰驼,构建 VHH 酵母双杂交文库,以 NDV 的 HN 蛋白(构象型抗原)为诱饵进行筛选,最终获得 7 个阳性纳米抗体;ELISA 与免疫细胞化学验证显示,这些纳米抗体均能特异性结合 NDV 及 HN 蛋白,且 6 个具有病毒中和活性,为 NDV 的诊断与治疗提供了关键工具。此外,Fu 等人以猪圆环病毒 2 型(PCV-2)的 Cap 蛋白为诱饵,从免疫双峰驼 VHH 文库中筛选到 21 个特异性纳米抗体,这些抗体可用于 PCV-2 的精准检测,证明酵母双杂交技术在病毒相关纳米抗体筛选中的优势。
三、两种技术的对比与选择建议
噬菌体展示技术与酵母双杂交技术各有优势,需根据研究目标与实验条件选择:
技术指标 | 噬菌体展示技术 | 酵母双杂交技术 |
---|---|---|
适用文库类型 | 免疫文库、naive 文库(高库容) | 免疫文库、合成文库(中低库容) |
抗原类型 | 可溶性抗原、膜蛋白(需纳米盘等辅助) | 构象型抗原、膜蛋白(真核折叠) |
筛选效率 | 快(1-2 周 / 3-5 轮) | 较慢(2-3 周 / 筛选 + 验证) |
优势 | 高库容、易操作、成本低 | 真核折叠、高灵敏度、无原核偏性 |
局限 | 原核表达可能导致蛋白错误折叠 | 库容较低、易出现自激活假阳性 |
选择建议:若需从超大库容文库(>10⁹)中快速初筛可溶性抗原特异性纳米抗体,优先选择噬菌体展示技术;若需筛选构象型抗原(如病毒表面蛋白)或需确保蛋白正确折叠的纳米抗体,优先选择酵母双杂交技术;实际研究中,也可采用 “噬菌体初筛 + 酵母双杂交验证” 的组合策略,兼顾筛选效率与准确性。
总结
噬菌体展示技术与酵母双杂交技术作为纳米抗体筛选的两大核心手段,分别从 “原核高效富集” 与 “真核精准互作” 两个维度,为科研人员提供了可落地的技术方案。随着技术的不断优化(如噬菌体展示与纳米盘、VLPs 结合以适配膜蛋白筛选,酵母双杂交与 CRISPR 技术结合以提升文库多样性),这两种技术的适用范围将进一步扩大。对于科研人员而言,理解两种技术的核心原理与实操要点,结合研究目标选择合适的筛选策略,是高效获得高质量纳米抗体的关键。未来,随着 AI 辅助设计、高通量测序等技术的融入,纳米抗体筛选将朝着 “更快速、更精准、更定制化” 的方向发展,为生物医药领域提供更多高性能的纳米抗体工具。