电致化学发光免疫分析技术，Electro-Chemiluminescence Immunoassay (ECLI)

电致化学发光免疫分析平台关键技术难点

引言

分析仪，包含三大交叉技术领域：磁性分离技术、电致化学发光技术、免疫分析技术。

免疫分析技术发展史

 免疫分析技术发展的三代

电化学发光 (Electrochemiluminescence ，ECL)，又称电致化学发光免疫(ECLIA)，是继放射免疫(RIA)、酶联免疫(ELISA)、时间分辨荧光免疫(TRFIA)、化学发光免疫(CLIA)测定以后的新一代标记免疫测定技术。 
多元免疫分析方法发展至今已有免疫聚合酶联反应技术、蛋白质微阵列芯片技术、流式细胞术、量子点技术以及多元均相时间分辨荧光免疫分析技术等。其中流式细胞术是发展比较完善的现代免疫分析技术，但其检测所需的设备和试剂盒昂贵，导致分析测试成本较高。
电化学发光法是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，包括了电化学和化学发光两个过程。
电化学发光 (Electro-Chemiluminescence ) 可以应用于所有的免疫测定，电化学发光能取代第一代放射免疫的灵敏度，又继承了第二代酶联免疫的通量方便，因而广泛被全球大量用户所认可和使用，从被载入了免疫分析技术发展的史册。

领导企业，美国MSD®（Meso Scale Discovery) 公司，在超敏多因子电化学发光分析技术相对于传统的酶联免疫吸附测定（ELISA）具有多项优势，这些优势使其在生物分析和生物标志物研究中成为一种强大工具。

电致化学发光免疫分析法（ECLIA）是一种高灵敏度、高特异性的免疫分析技术，结合了电化学发光和免疫分析的优势。其关键技术主要包括以下几个方面：

一、电致化学发光 (ECL) 定义

电致化学发光(ECL) 是 通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。
ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。因此ECL反应易精确控制，具有灵活性。

电化学发光免疫分析法(ECLIA)
ECLI是继EIA、RIA、FIA、时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后的新一代标记免疫测定技术；
ECLI是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物；
ECLI是目前最先进的标记免疫测定技术之一。

电化学发光剂

定义：指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。
特点：
反应在电极进行
化学发光剂：三联毗啶钌
电子供体为：三丙胺（TPA）　

ECLI原理

　　在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，用电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+标记Ab，通过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。

方法评价

        采用的固相载体“磁性微粒”是带有磁性的直径约2.8 μm的聚苯乙烯微粒。其特点是反应面积比板式扩大20－30倍，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度大大加快；
        “链霉亲和素-生物素”是是具有很强的非共价相互作用的一对化合物，具有牢固而特异的结合，应用此放大系统，使检测的灵敏度大大提高；
        利用氧化铁的磁性，使用电磁场分离结合态和游离态，方便迅速，实现了精确的全自动化；
        标记物的再循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定。

ELIA优越性

　　高度敏感，可达pg／ml或pmol水平；
　　特异性强，重复性好，CV＜5％。
       测定范围宽，可达7个数量级。
       试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长，达数月甚至数年。
       操作简单，耗时短，易于自动化。
       在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。

二、关键技术点

1. 电化学发光技术

电化学发光反应：通过电化学反应生成激发态物质，退激时发出光子。常用的发光体系是三联吡啶钌（Ru(bpy)₃²⁺）和三丙胺（TPA）体系。

电极材料：电极是电化学反应的核心，常用材料包括金、铂、碳等，需具备良好的导电性和化学稳定性。

电位控制：精确控制电极电位以触发和维持发光反应，确保反应的可重复性和稳定性。

 

2. 免疫分析技术

抗原-抗体反应：利用抗原与抗体的特异性结合进行检测，标记物通常为三联吡啶钌或其衍生物。

固相载体：常用磁性微球作为固相载体，便于分离和清洗，提高检测灵敏度。

信号放大：通过酶联反应或纳米材料放大信号，提升检测灵敏度。

3. 光学检测系统

光电倍增管（PMT）：用于检测微弱光信号，需具备高灵敏度和低噪声。在400~750nm的可见光区，电化学发光反应的自由能至少要 299~159kJ

光路设计：优化光路以提高光信号收集效率，减少背景干扰。

滤光片：选择特定波长的滤光片，确保检测到目标发光信号。

4. 微流控技术

微流控芯片：集成样品处理、反应和检测功能，减少试剂消耗，提高分析速度。

流体控制：精确控制样品和试剂的流动，确保反应均匀和稳定。

磁性微粒/磁性分离：国外知名厂家有，赛默飞；国内知名厂家有，博岳、纳薇、英苪诚、为度

5. 自动化与控制系统

自动化样品处理：实现样品加载、反应、清洗和检测的自动化，提高效率和一致性。

控制系统：集成电化学、光学和流体控制模块，确保各步骤的精确协调。

6. 数据处理与分析

信号处理：对检测信号进行滤波、放大和数字化处理，提高信噪比。

数据分析：通过标准曲线或数学模型定量分析目标物浓度，确保结果准确。

7. 试剂与标记物

标记物：常用三联吡啶钌作为标记物，因其发光效率高且稳定。

试剂稳定性：确保试剂在储存和使用过程中保持稳定，保证检测结果的可靠性。

8. 系统集成与优化

模块化设计：各功能模块化设计，便于维护和升级。

系统优化：通过优化各模块性能，提升整体检测灵敏度、准确性和稳定性。

总结
电化学发光免疫分析仪的关键技术涵盖电化学发光、免疫分析、光学检测、微流控、自动化控制、数据处理和试剂开发等多个领域。这些技术的协同作用使其在临床诊断和生物医学研究中具有广泛应用。

 

三、电化学发光免疫分析技术的国产之路

参考：电化学发光免疫分析技术的国产之路

深圳普门科技技术创新上的突破

①设备方面：

A、可控的电致发光电液控制时序技术
电化学分析过程需要多种不同液体参与进行，包括缓冲液、清洗液和待测的反应复合物等。参与反应的液体应严格按照液路控制时序的要求，在相应时序以不同的流速精确的吸入或排出电化学测量池。当液体流经测量池时，恒电位电路系统应精确的输出各种激发电压，以实现对电极的初始化、电氧化、电致发光、清洗和电还原等一系列复杂的控制动作。
公司的可控电致发光电液控制时序技术解决了液体和电路复杂的同步控制难题，使得每次发光时刻和电极状态高度一致，保证了测试结果的准确性。

B、可控的流通式磁分离技术
电化学发光采用了流通式磁分离技术，该技术对待测磁珠复合物在检测区的停留位置、分布形态和留存率的要求高，保证待测物能够充分、均匀的分布在检测区电极表面。
公司的流通式磁分离技术采用平行磁场设计，使磁珠的落点更精确；同时采用缓冲式扁平流道设计，使待测磁珠复合物能够均匀、平稳地流到电化学发光检测区，保证分布的均匀性。公司的流通式磁分离技术可控性高，解决了磁珠分布不均匀、流失率高等难题，保证了磁珠的分布一致性和留存率。

②试剂方面：

A、电化学发光标记物的自主合成
公司采用自主合成的电化学发光标记物三联吡啶钌，在反应时具有背景噪音低、发光强度高、动态范围宽、灵敏度高、即时发光等特点。公司基于自主合成的电化学发光标记物三联吡啶钌标记抗体或抗原，减少对抗体活性的影响，可最大程度保留抗体的高亲和力和选择性。三联吡啶钌具有分子量小、化学性质稳定、水溶性好等特点，保证了试剂的高灵敏度、特异性和低干扰。

B、磁微粒表面异相富集技术
公司采用的磁微粒表面异相富集技术使磁微粒表面结合大量的链霉亲和素分子，再磁吸到电极表面形成局部富集区，因此发光更集中、光强度更强、信噪比更高