Adv Sci | 赵英明/黄河及合作者发现组蛋白全新修饰—赖氨酸乙酰乙酰化

 

细胞内代谢物及其相关代谢途径的发现和特征是细胞代谢的核心。尽管我们对细胞代谢物及其在代谢中的作用有不断深入的了解，但对代谢物的非代谢功能研究相对较少。最近，许多代谢物被报道为蛋白质翻译后修饰(PTMs)的前体和辅助因子，参与调节细胞功能[1]。例如，乙酸和琥珀酸分别是赖氨酸乙酰化(Kac)和赖氨酸琥珀酰化修饰(Ksucc)的前体，同时乙酰辅酶A与琥珀酰辅酶A也是赖氨酸甲基化的辅助因子[2, 3]。这些修饰可以通过酶促或自发的化学反应形成，表明细胞代谢与蛋白质修饰之间存在着紧密联系。近年来，越来越多的赖氨酸酰化修饰被发现，如赖氨酸2-羟基异丁酰化（Khib）和巴豆酰化(Kcr)，它们利用短链脂肪酸代谢产物作为前体，其相应的辅酶A作为辅助因子。这些酰化修饰是由酰基转移酶（Writer）和去酰化酶（Eraser）这两类酶动态调控，它们分别催化修饰基团的添加和去除[4]。越来越多的证据表明，赖氨酸酰化修饰与生理病理变化密切相关，并参与多种疾病的进展 [5-7]。

当葡萄糖不容易获得时，肝脏中的脂肪酸通过生酮作用产生β-（BHB）、乙酰乙酸、丙酮这三种酮体。多年来，这些分子一直被认为是外周组织的替代能源，比如心脏和大脑。然而，这一长期存在的范式最近也受到了挑战，因为BHB可以通过β-羟基丁酰辅酶A作为组蛋白Kbhb的前体发挥作用，其中p300和HDAC1、HDAC2分别作为“Writer”和“Eraser”动态调控kbhb水平。此外，通过体外实验，组蛋白Kbhb可以直接刺激基因表达，并与饥饿相关基因的活跃表达有关；另外非组蛋白的Kbhb修饰也参与了癌症发生发展，免疫反应等[8]。那么基于Kbhb及其调控机制的发现，研究人员不禁会提出假设：是否另一种酮体分子乙酰乙酸也可以作为其相应赖氨酸乙酰乙酰化（Lysine acetoacetylation, Kacac）修饰的前体发挥功能呢？这确实值得进一步的探究。
近日，芝加哥大学赵英明教授团队、中国科学院上海药物研究所黄河教授团队与成均馆大学药学院Sangkyu Lee教授团队联合在Advanced Science (IF=15.1)上在线发表了题为“Identification of histone lysine acetoacetylation as a dynamic post-translational modification regulated by HBO1”的最新研究成果[9]。该研究首次报道了组蛋白的赖氨酸乙酰乙酰化（Kacac）修饰，并在哺乳动物中鉴定了33个组蛋白Kacac修饰位点，描绘了跨物种和器官的组蛋白Kacac修饰全景图。此外研究还证明Kacac修饰的“Writer”和“Eraser”分别HBO1与HDAC3。景杰生物为本研究提供多种酰化修饰泛抗体，包括Kacac、Kac、Kpr、Kcr、Kbhb和Kbu。

 

先前的研究表明，短链脂肪酸可作为赖氨酸酰化修饰的前体，因此作者假设乙酰乙酸也可能是Kacac的前体，其作用方式类似于乙酸作用于Kac, BHB作用于Kbhb。在一般情况下，PTM的鉴定采用的是质谱法，即通过测量肽段序列中修饰氨基酸残基的质量偏移判断对应氨基酸上发生了何种修饰。基于这一原理，通过对Kacac的化学式（C4H4O2）进行分析，预测其修饰肽段的质量偏移为+84.0211 Da。为了寻找发生Kacac修饰的肽段，作者设计了一个蛋白质组学工作流程：首先从培养的人细胞和大鼠肝脏中提取核心组蛋白，然后用胰蛋白酶进行蛋白水解获得肽段，这些肽段通过HPLC-MS/MS分析及蛋白质序列比对后，最终鉴定出在赖氨酸残基处质量偏移为+84.0211 Da的肽段。这种方法使作者能够在不同物种中鉴定出几种可能由Kacac修饰引起赖氨酸质量偏移的组蛋白肽段。值得一提的是，这些肽段在检测前没有使用Kacac泛抗体进行常规富集就能鉴定到较多修饰肽段，这表明Kacac肽段丰度还是相当可观的。

 

 

图1 蛋白质组学方法鉴定Kacac修饰

 

接着，作者在人类HepG2和MCF7细胞系中利用上述的蛋白质组学方法，确定了30个在赖氨酸残基上具有+84.0211 Da质量偏移的肽段，其中包括H3K9、H3K18、H4K31等位点。虽然作者观测到的质量偏移与预测的Kacac质量偏移完全匹配，但考虑到可能存在同分异构体这种情况，因此还需要更深入的验证。进一步地，作者合成了三个具有代表性的含有Kacac的肽段：H3K9 (KacacSTGGKprAPR)， H3K18(KacacQLATKprAAR)和H4K31 (DNIQGITKacacPAIR)。质谱结果与作者的预期一致，合成肽段(H4K31, DNIQGITKacacPAIR)显示出与内源性对应肽段几乎相同的碎裂片段。此外，两种肽段在HPLC中共洗脱。这两条线索有力地表明，赖氨酸+84.0211 Da的质量偏移确实归因于Kacac修饰。此外，为了验证乙酰乙酸是否为Kacac的前体，作者进行了同位素标记实验。他们在HepG2和MCF7细胞中添加10 mM的¹³C₂-乙酸乙酯(EAA)培养24小时，然后提取核心组蛋白进行PRM检测。通过分析，作者分别在HepG2细胞和MCF7细胞中鉴定出5个和6个同位素标记的Kacac位点。综上所述，这些结果都证明乙酰乙酸是组蛋白Kacac的前体，类似于其他类型的短链脂肪酸对组蛋白赖氨酸酰化的作用。

 

 

图2 利用合成肽和同位素标记验证赖氨酸Kacac

 

为了证实Kacac的真实性与有效性，作者尝试产生一种针对Kacac的泛抗体进行验证。作者首先使用kacac修饰的肽段作为免疫原去免疫家兔，但在家兔中并没有观察到修饰特异性免疫原反应。作者认为，在生理条件下，甲基异恶唑基团可以转化为乙酰乙酰基的结构类似物。因此，他们合成赖氨酸残基上带有甲基异恶唑片段的肽段作为替代抗原，生成了kacac泛抗体。接着，作者利用含有Kacac、Kcr、Khib、Ksucc和未修饰赖氨酸的肽段库，通过点印迹法证实了所产生的抗Kacac抗体的特异性。利用这种Kacac泛抗体，作者在人类、褐家鼠和斑马鱼等物种的组蛋白中均检测到Kacac修饰。鉴于酮体是一组进化保守的代谢物，Kacac极有可能与Kac和Kcr类似，在多种物种中普遍存在。此外，该抗体也为各种生化分析，如免疫荧光和免疫沉淀等实验的开展奠定了基础。

 

图3 kacac泛抗体的生产流程与验证

 

越来越多的证据表明，经典的乙酰转移酶也可以调控各种新发现的酰基修饰。因此，作者假设一些乙酰转移酶可能具有乙酰乙酰转移酶的功能。为了验证这一假设，作者用分别构建了五种常规乙酰转移酶（即p300、GCN5、HBO1、Tip60和MOF）的质粒并转染HEK293T细胞。这些酶的过表达均上调了Kac水平，同时组蛋白Kacac水平均有不同程度的升高，其中GCN5和HBO1过表达导致的Kacac升高最为明显，但HBO1调控的组蛋白Kacac位点更多，且位点的占用率更高。因些，这些结果表明HBO1是一种调节多种组蛋白Kacac位点的乙酰乙酰转移酶。此外，为了证实HBO1的酶活性，作者在HEK293T细胞中过表达了HBO1野生型和催化活性丧失的突变体(G485A/E508Q)。结果表明，HBO1野生型过表达增强组蛋白Kacac水平，而HBO1突变体则消除了这种增强。进一步地，为了更好地了解HBO1乙酰乙酰转移酶活性的分子机制，作者基于HBO1与乙酰辅酶A的结合情况，利用AutoDock对HBO1与乙酰乙酰辅酶A的结合进行了三维硅分子建模，结果发现HBO1中的CoA结合袋允许乙酰乙酰辅酶A的结合，同时形成疏水相互作用。以上这些研究结果，从多个角度证明HBO1与乙酰乙酰辅酶A结合并通过关键赖氨酸残基发挥其催化活性。

 

 

图4 HBO1是赖氨酸乙酰乙酰转移酶

 

众所周知，PTM修饰是动态调控的，且酰化修饰的去修饰酶主要为HDACs家族及Sirtuins (SIRTs)家族蛋白。因此，作者假设Kacac可能也受到这些去修饰酶的调控。为了验证这一假设，作者采用HDAC抑制剂亚酰苯胺羟肟酸(SAHA)或SIRTs抑制剂烟酰胺处理HepG2细胞，并在处理后24小时通过免疫印迹检测组蛋白Kacac水平。在SAHA处理后，组蛋白Kacac与Kac水平一致，呈浓度依赖性增强，而烟酰胺处理后无显著变化。为了进一步确定哪种特定的HDAC酶具有去乙酰乙酰化酶活性，作者使用合成的Kacac肽段，在体外对HDAC家族蛋白进行酶活筛选，通过LC-MS/MS量化未修饰肽段的比例，作者发现只有HDAC3表现出明显的去乙酰乙酰化酶活性。这一结果表明，HDAC3在体外可以催化去除组蛋白的乙酰乙酰化修饰。

 

 

图5 HDAC3为是赖氨酸去乙酰乙酰化酶

为了更全面地了解Kacac位点，作者将从大鼠器官中鉴定到的Kacac位点与人HepG2和MCF7细胞中检测到的Kacac位点结合起来，并在核心组蛋白上进行标记，一共鉴定到33个Kacac位点，其中大多数位点在人和大鼠中都能检测到。接着，作者将发现的所有Kacac位点与其他常见的组蛋白赖氨酸短链酰化（包括Ksucc、Kla、Kcr、Kac）进行对比，发现大部分Kacac位点与先前确定的赖氨酸酰化修饰位点存在重叠

图6 组蛋白Kacac修饰全景图

综上所述，该研究报道了一种由乙酰乙酸诱导的新修饰—赖氨酸乙酰乙酰化，并且在哺乳动物组蛋白上总共检测到33个Kacac位点，其中一些已确定的位点在不同的物种中是保守的，这意味着这些位点可能存在进化上的保守功能。此外，通过体外生化实验，确定了Kacac修饰的“Writer”和“Eraser”分别HBO1与HDAC3。因此，这一研究揭示了一种以前未有探索的PTM途径，该途径将酮体与组蛋白表观遗传调控联系起来。当然，该研究也提出了关于Kacac调控机制和功能的其他问题。例如，Kacac的“Reader”蛋白是什么？组蛋白Kacac的表观遗传功能是什么？哪些非组蛋白可以被Kacac修饰，其功能是什么？这些问题都值得研究人员进行更深层次的探索，以挖掘Kacac在生理及病理过程中的功能机制。
参考文献：

[1] Sabari BR, et al. 2017. Metabolic regulation of gene expression through histone acylations. Nat Rev Mol Cell Biol.

[2] Walsh CT, et al. 2005. Protein posttranslational modifications: the chemistry of proteome diversifications. Angew Chem Int Ed Engl.

[3] Dancy BM, et al. 2015. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chem Rev.

[4] Komaniecki G, et al. 2021. Lysine Fatty Acylation: Regulatory Enzymes, Research Tools, and Biological Function. Front Cell Dev Biol.

[5] Liberti MV, et al. 2020. Histone Lactylation: A New Role for Glucose Metabolism. Trends Biochem Sci.

[6] Zhang D, et al. 2019. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature.

[7] Pougovkina O, et al. 2014. Aberrant protein acylation is a common observation in inborn errors of acyl-CoA metabolism. J Inherit Metab Dis.

[8] Xie Z, et al. 2016. Metabolic Regulation of Gene Expression by Histone Lysine beta-Hydroxybutyrylation. Mol Cell.

[9] Gao Y, et al. 2023. Identification of Histone Lysine Acetoacetylation as a Dynamic Post-Translational Modification Regulated by HBO1. Adv Sci.

 

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