大咖访谈：李恒、张国捷、阮珏 T2T基因组时代：生命密码的终极解码之路（上）

大咖访谈：李恒、张国捷、阮珏

《GigaScience》期刊的T2T系列专题自去年推出以来，发表了一系列T2T基因组组装方法和基因组数据集。该专题成功开展，从最初的方法学论文，扩展到大量动植物T2T基因组，特别是具有农业价值的物种。这充分展示了基因组科学的快速进步，以及对完整基因组组装的追求。

T2T基因组数量的激增也引发了对"完整基因组"定义的审视与争议。为此，我们采访了T2T专题特邀编辑阮珏研究员、Fritz J Sedlazeck教授，浙江大学张国捷教授，以及T2T联盟的多位专家。我们就质量标准、基准和阈值向专家们进行访谈，获得了关于T2T这一说法的适用性、完整基因组最低要求以及基因组学未来发展方向的深刻见解。后续我们将通过微信公众号系列推文分享这些观点。

本篇推文汇集了基因组组装算法专家李恒博士（哈佛医学院）、演化生物学专家张国捷教授（浙江大学）和专题特邀编辑阮珏研究员（中国农业科学院 深圳农业基因组研究所）的方法学视角。

问

01

“T2T“这一说法的合理性

自三年前“T2T联盟“发布人类完整基因组序列以来，"T2T"已成为完整参考基因组的代名词，不仅适用于人类，也广泛应用于动植物等所有物种。T2T快速发展的原因是什么？"T2T"这一说法是否合适？

张国捷：长读长测序技术和算法突破是主因，标准化流程降低了技术门槛。但更要强调的是T2T基因组带来的生物学洞见——着丝粒/表观遗传结构、MHC复合区、人类Y染色体等复杂区域的研究都因此受益。

李恒：高精度长读长测序的发展是决定因素。若能真正实现从端粒到端粒的精确组装，“T2T”这一说法还是恰当的，但现实中许多基因组没有经过严格的校验而并未达到这一标准。

阮珏：多数研究者已将T2T等同于完整基因组组装，这个说法可以接受。

张国捷特别指出****：尽管T2T现在已成为一种趋势，我完全理解T2T基因组对每个物种的价值，但我想指出，这不应被视为开展基因组研究的唯一标准或先决条件。科学项目应该优先考虑问题驱动的设计，而不是只是追求组装的完美主义。许多关键的生物学问题可以通过基因组草图有效地解决，这使得T2T在许多应用中不是必要的。实际上，对T2T的追求给一些研究施加了令人望而却步的限制：“DNA要达到Mb长度“这一要求排除了小型生物和馆藏标本，而高昂的测序/计算成本可能会导致无法进行更广泛的采样或多组学整合。强制实施T2T可能会推迟濒危物种的保护基因组学，并在资源有限的情况下使研究人员处于不利地位，无意中扼杀方法学创新。

问

02

用“T2T“表示基因组的完整性是否准确？

张国捷：尽管"T2T"强调染色体末端，但更准确的"完整基因组组装"（CGA）可能更合适。折中方案如"T2T-CGA"或许能兼顾准确性与辨识度。

阮珏：当前学界广泛认可“T2T“代表”完整基因组组装“。

问

03

质量评估标准

十多年前，Assemblathon和Assemblathon 2竞赛突显了基因组组装之间的高度可变性，并帮助实现了更标准化的评估和比较参考基因组质量的方法。您认为我们是否再次处于基因组学的类似拐点？您认为真正的T2T基因组所需的最低要求是什么？

张国捷：组装和评估一个真正完整的基因组无疑是一项挑战。现有所有T2T基因组（包括人类CHM13）仍存在需优化的区域。T2T-CGA作为一个标准指高质量且完整覆盖的基因组组装。有些团队在无法达到T2T-CGA的情况下，用“接近或者半T2T基因组“来妥协，这使得T2T-CGA的标准变得没有意义。我们必须认识到，单一标准不应普遍适用于所有基因组项目。质量指标应该根据基因组的预期用途量身定制，建立不同的质量标准。同样，T2T-CGA质量反映的是技术能力，而不是科学价值。建议不要根据这一指标来简单的评估研究工作的质量。

李恒：严格来说，CHM13也未达到T2T标准（rDNA未组装），我个人倾向于采用"Near T2T"这一说法。在我看来，"Near T2T"至少应将部分染色体完整组装，并且平均起来每条染色体上的gap加上结构性组装错误应限于个位数。我对T2T的标准是将除rDNA外序列全部组装，并且平均起来每条染色体上结构性错误不超过一个。

问

04

填补gap的挑战

填补gap有多难？您认为处理该问题的最佳方法是什么？

李恒：Gap修补取决于具体情况。如果组装图（assembly graph）是连续的，我们可以手动检查和跟踪图中的路径。我们可以对gap周围的contigs进行比对，看看它们是否有重叠，或者比对超长read，看看其中一些是否可以跨越这个gap并且有SUNK-mer支持。有时比较不同软件的组装也会有用。但这些做法均可能导致组装错误，需要仔细验证才行。

阮珏：填补gap是T2T基因组组装中最大的问题。大多数工具依赖于测序技术的进步，但在对串联重复序列进行序列比对和变异位点识别方面进展甚微。因此，目前组装出来的T2T基因组都是比较幸运的。

问

05

质量评估指标推荐

您能推荐一些具体的指标用来评估T2T基因组质量吗？以及是否有特定的基准测试方法？

李恒：如果数据足够，主流组装软件可以完整组装许多物种的多条染色体，而且它们自动化程度高，入手门槛低。但因为没有软件能精确地自动评价一个组装是否达到T2T，目前验证比组装更需要经验和时间。如果旁系物种有很好的注释，BUSCO/compleasm完整性是起码要求。如果完整性比较低，需给出合理解释（比如缺少旁系物种或最近有全基因组范围的结构变化）。建议补充Nucfreq或GCI的衡量错误组装结果图，可将这些图作为补充材料上传。

张国捷：真正的T2T-CGA基因组应该满足以下标准：1）端粒到端粒的完整染色体覆盖；2）无gap（contig长度=染色体长度）；3）已验证倍性的分型单倍型（尤其是性染色体）；4）碱基错误率<0.01%（Q50）；5）组装完整的着丝粒/端粒重复序列。

阮珏：碱基错误率<= e-6；每条染色体的潜在结构错误<10处；结构错误可以多于碱基错误。

问

06

T2T时代的展望

现在我们有了人类T2T参考基因组（以及越来越多的非人类参考基因组）；您认为该领域的下一步发展方向是什么？

张国捷：T2T-CGA在人类中的应用可以真正促进个人基因组医学的发展。每个人将来都应该有自己的T2T-CGA。如果为每个物种生产T2T-CGA的目标过于遥远和昂贵，那么为每个分类群（目/科/属）确定一个具有代表性的物种建立T2T-CGA参考基因组，将是生物多样性基因组学研究的一个非常有价值的工作。

阮珏：未来结合T2T和泛基因组，大多数生物信息学工具都需要适配和重构，未来的基因组分析场景将会是全新的。

敬请关注本系列后续推文；点击“阅读原文“可跳转至T2T专题页面。

参考文献：

Nurk S et al. The complete sequence of a human genome. Science. 2022 Apr;376(6588):44-53. doi: 10.1126/science.abj6987.

Bradnam KR, et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. Gigascience. 2013 Jul 22;2(1):10. doi: 10.1186/2047-217X-2-10.

Huang N, Li H. compleasm: a faster and more accurate reimplementation of BUSCO. Bioinformatics. 2023 Oct 3;39(10):btad595. doi: 10.1093/bioinformatics/btad595.

Chen Q, Yang C, Zhang G, Wu D. GCI: a continuity inspector for complete genome assembly. Bioinformatics. 2024 Nov 1;40(11):btae633. doi: 10.1093/bioinformatics/btae633.