淼灵共享质粒|兰州大学武磊老师课题组SCF泛素Duet质粒

兰州大学生命科学学院武磊老师课题组将自主构建并经实验验证的13株Duet系列原核双表达质粒分享至淼灵质粒共享平台。该系列载体已应用于课题组在SCF型E3泛素连接酶与泛素化级联领域的研究，相关学术成果发表于《Biomolecules》（MDPI，2024年第14卷第10期，DOI:10.3390/biom14101209）。

文章数据可用性部分明确标注，该系列质粒可通过淼灵生物平台获取。

泛素化是真核生物中调控蛋白降解与功能的关键翻译后修饰，SCF（SKP1-CUL1-F-Box）型E3泛素连接酶是其中规模更大、功能更多的一类多亚基E3复合物。传统体外泛素化实验需要纯化所有级联组分，操作繁琐、蛋白活性难以维持。武磊老师课题组基于Duet双表达载体系统，构建了覆盖泛素化级联全组分的质粒套装，通过多质粒共转化在大肠杆菌里共表达E1活化酶、E2结合酶、泛素、SCF复合物四亚基及底物蛋白，成功在原核细胞中重构了完整的泛素化反应。

在该项研究中，团队利用这套质粒分别验证了拟南芥AtSCF^TIR1介导的生长素底物泛素化、以及人源SCF^FBXO28的自泛素化效应，证明该细菌系统可用于SCF型E3连接酶的底物鉴定、机制解析与药物筛选，大幅降低了泛素化实验的技术门槛。

所有载体均经过课题组功能验证，序列准确、表达稳定，科研人员获取后可直接组合使用，无需从零完成载体设计与构建。

非常感谢兰州大学武磊老师课题组对淼灵质粒平台的信任，将自研实验质粒对外公开分享。目前这批质粒已完成平台标准化质检，正式上架淼灵质粒平台，供科研工作者查询采购。

本次分享质粒的信息如下：

质粒货号	质粒名称	抗性	感受态	培养温度
P74686	pCDFDuet-AtUBC8-S-AtUBA1-S	Spe	BL21	37℃
P74956	pRSFDuet-HIS-FLAG-AtUBQ11	Kan	BL21	37℃
P74715	pETDuet-AtRBX1-T7-AtASK1(AtSKP1)-T7-AtCUL1-S	Amp	BL21	37℃
P74197	pACYCDuet-Myc-MBP-HA	Chl	BL21	37℃
P74689	pACYCDuet-AtTIR1-Myc-MBP-HA	Chl	BL21	37℃
P74716	pACYCDuet-AtTIR1P10A-Myc-MBP-HA	Chl	BL21	37℃
P74687	pCDFDuet-AtUBA1-S	Spe	BL21	37℃
P74686	pCDFDuet-AtUBC8-S-AtUBA1-S	Spe	BL21	37℃
P74717	pACYCDuet-AtTIR1-Myc-MBP-AtIAA6-HA	Chl	BL21	37℃
P74718	pACYCDuet-Myc-MBP-AtIAA6-HA	Chl	BL21	37℃
P75523	pETDuet-1-AtRBX1-T7-HsSKP1-T7-AtCUL1-S	Amp	BL21	37℃
P74198	pACYCDuet-HsFBXO28-Myc-MBP-HA	Chl	BL21	37℃
P74719	pACYCDuet-ΔHsFBXO28-Myc-MBP-HA	Chl	BL21	37℃

该系列载体均适配BL21系列大肠杆菌感受态细胞，37℃常规培养、IPTG诱导即可实现蛋白表达。不同复制子、不同抗性的载体可灵活组合共转化，适配不同SCF复合物与底物的泛素化实验需求。

质粒简介

pCDFDuet-AtUBC8-S-AtUBA1-S（P74686）

该载体以pCDFDuet-1双表达骨架为基础，两个多克隆位点分别克隆拟南芥泛素活化酶AtUBA1、泛素结合酶AtUBC8编码序列，两个蛋白C端均融合S标签，携带壮观霉素（Spe）抗性元件。

AtUBA1作为E1酶负责ATP依赖的泛素活化，AtUBC8作为E2酶负责承接并传递泛素；S标签可用于蛋白免疫检测与亲和纯化。两个单独表达盒可在同一细菌中同步表达两种功能酶，保证泛素化级联的上游启动。

该载体是泛素化级联的上游关键组分质粒，需与SCF复合物质粒、泛素质粒、底物质粒共转化使用，共同组成完整的细菌泛素化反应系统。

推荐感受态：BL21，培养温度37℃，适合开展泛素化级联重构、E1/E2酶功能验证相关研究。

pRSFDuet-HIS-FLAG-AtUBQ11（P74956）

该载体以pRSFDuet-1双表达骨架为基础，克隆N端融合His-FLAG双标签的拟南芥泛素AtUBQ11编码序列，携带卡那霉素（Kan）抗性元件。

His-FLAG双标签可分别用于镍柱亲和纯化与免疫印迹检测；泛素分子是泛素化反应的供体，经E1活化后通过E2传递，共价结合到底物蛋白的赖氨酸残基上。

该载体为泛素化反应提供泛素分子，是细菌泛素化系统的关键组分之一。

推荐感受态：BL21，培养温度37℃，适合开展泛素化反应、蛋白泛素化修饰检测相关研究。

pETDuet-AtRBX1-T7-AtASK1(AtSKP1)-T7-AtCUL1-S（P74715）

该载体以pETDuet-1双表达骨架为基础，通过多顺反子设计共表达拟南芥SCF复合物三个关键亚基：AtRBX1、AtASK1（AtSKP1）与AtCUL1；AtRBX1与AtASK1C端带T7标签，AtCUL1C端带S标签，携带氨苄青霉素（Amp）抗性元件。

AtCUL1作为骨架蛋白搭建复合物整体结构，AtRBX1提供RING结构域结合E2-泛素复合物，AtASK1作为衔接蛋白特异性结合F-box蛋白，三者共同组装形成有功能的SCFE3泛素连接酶关键骨架；不同标签可分别用于各亚基的表达检测。

该载体是SCF型E3连接酶的关键表达质粒，搭配不同F-box底物质粒即可研究不同SCF复合物的功能。

推荐感受态：BL21，培养温度37℃，适合开展SCF复合物组装、E3泛素连接酶功能验证相关研究。

pACYCDuet-Myc-MBP-HA（P74197）

该载体以pACYCDuet-1双表达骨架为基础，为F-box蛋白与底物蛋白的克隆空骨架，分别设计Myc标签与MBP-HA标签克隆位点，携带氯霉素（Chl）抗性元件。

Myc标签用于标记F-box蛋白，MBP-HA双标签用于标记底物蛋白，可通过免疫印迹检测泛素化修饰的梯形条带。

该载体为基础克隆骨架，可根据研究需求插入不同F-box基因与底物基因，构建个性化泛素化研究质粒。

推荐感受态：BL21，培养温度37℃，适合开展自定义F-box与底物的泛素化研究。

pACYCDuet-AtTIR1-Myc-MBP-HA（P74689）

该载体以pACYCDuet-1双表达骨架为基础，克隆拟南芥F-box蛋白AtTIR1（C端Myc标签），保留MBP-HA标签克隆位点，携带氯霉素（Chl）抗性元件。

AtTIR1是植物生长素信号通路的关键F-box受体，可与ASK1结合形成SCF^TIR1复合物，识别生长素底物蛋白并介导其泛素化降解；Myc标签可用于检测F-box蛋白的表达与自泛素化条带。

该载体用于研究SCF^TIR1复合物的自泛素化活性，也可插入底物蛋白研究底物泛素化。

推荐感受态：BL21，培养温度37℃，适合开展生长素信号通路、SCF^TIR1泛素化机制相关研究。

pACYCDuet-AtTIR1P10A-Myc-MBP-HA（P74716）

该载体以pACYCDuet-1双表达骨架为基础，克隆F-box结构域突变的AtTIR1^P10A（C端Myc标签），携带氯霉素（Chl）抗性元件。

AtTIR1^P10A突变体丧失与AtASK1的结合能力，无法组装形成功能性SCF复合物，在研究中作为阴性对照，验证泛素化反应依赖于完整SCF复合物的组装。

该载体是SCF^TIR1泛素化研究的对照质粒，用于排除非特异性泛素化干扰。

推荐感受态：BL21，培养温度37℃，适合开展泛素化反应特异性验证、F-box功能域研究。

pCDFDuet-AtUBA1-S（P74687）

该载体以pCDFDuet-1双表达骨架为基础，只克隆C端带S标签的拟南芥泛素活化酶AtUBA1，携带壮观霉素（Spe）抗性元件。

该载体只表达E1活化酶，不表达E2结合酶，在泛素化实验中作为缺失E2的阴性对照，用于验证泛素化反应对E2酶的依赖性。

推荐感受态：BL21，培养温度37℃，适合开展泛素化级联组分必要性验证、对照实验设置相关研究。

pCDFDuet-AtUBC8-S-AtUBA1-S（P74686）

该载体以pCDFDuet-1原核双表达骨架为基础，两个单独表达盒分别克隆拟南芥泛素结合酶AtUBC8、泛素活化酶AtUBA1编码序列，两个蛋白的C端均融合S标签，携带壮观霉素（Spe）抗性元件。

AtUBA1作为泛素化级联中的E1活化酶，可在ATP依赖条件下活化泛素分子并形成硫酯中间体；AtUBC8作为E2结合酶，承接活化的泛素并将其传递至下游E3泛素连接酶；S标签可用于重组蛋白的免疫印迹检测与亲和纯化。双表达盒设计可在同一株大肠杆菌中同步表达两种功能酶，为泛素化反应提供上游酶学组分。

该载体是细菌泛素化重构系统的上游关键组分，需搭配泛素质粒、SCF复合物质粒与底物质粒共转化使用，共同组装完整的原核泛素化反应体系。

推荐感受态：BL21，培养温度37℃，适合开展泛素化级联重构、E1/E2酶功能验证、泛素传递机制相关研究。

pACYCDuet-AtTIR1-Myc-MBP-AtIAA6-HA（P74717）

该载体以pACYCDuet-1双表达骨架为基础，共表达AtTIR1-Myc与底物蛋白AtIAA6-MBP-HA，携带氯霉素（Chl）抗性元件。

AtIAA6是生长素信号通路中SCF^TIR1的经典底物蛋白，生长素存在时可被TIR1识别并发生泛素化降解；HA标签可用于检测底物的泛素化修饰梯形条带。

该载体可直接用于验证SCF^TIR1对底物AtIAA6的泛素化活性，是生长素泛素化通路研究的关键工具质粒。

推荐感受态：BL21，培养温度37℃，适合开展底物泛素化验证、生长素信号通路机制研究。

pACYCDuet-Myc-MBP-AtIAA6-HA（P74718）

该载体以pACYCDuet-1双表达骨架为基础，只表达底物蛋白AtIAA6-MBP-HA，不表达F-box蛋白，携带氯霉素（Chl）抗性元件。

该载体作为无F-box的阴性对照，用于验证底物的泛素化修饰严格依赖于SCFE3连接酶的介导，排除底物自身发生非特异性泛素化的干扰。

推荐感受态：BL21，培养温度37℃，适合开展泛素化反应特异性验证、底物非特异性修饰排查相关研究。

pETDuet-1-AtRBX1-T7-HsSKP1-T7-AtCUL1-S（P75523）

该载体以pETDuet-1双表达骨架为基础，共表达AtRBX1-T7、人源HsSKP1-T7与AtCUL1-S，组装跨物种SCF关键骨架，携带氨苄青霉素（Amp）抗性元件。

将拟南芥CUL1/RBX1与人源SKP1组合，可适配人源F-box蛋白的特异性识别，用于研究人源SCF复合物的泛素化功能。

该载体是人源SCF型E3连接酶研究的关键骨架质粒，搭配人源F-box质粒即可开展相关泛素化实验。

推荐感受态：BL21，培养温度37℃，适合开展人源SCF复合物组装、跨物种E3连接酶功能研究。

pACYCDuet-HsFBXO28-Myc-MBP-HA（P74198）

该载体以pACYCDuet-1双表达骨架为基础，克隆人源F-box蛋白HsFBXO28（C端Myc标签），携带氯霉素（Chl）抗性元件。

HsFBXO28是人类SCF型E3连接酶的F-box亚基，可与SKP1结合形成SCF^FBXO28复合物并发生自泛素化；Myc标签可用于检测蛋白表达与泛素化条带。

该载体用于研究人源SCF^FBXO28复合物的自泛素化活性，也可插入对应底物开展底物泛素化研究。

推荐感受态：BL21，培养温度37℃，适合开展人源E3泛素连接酶、FBXO28功能机制相关研究。

pACYCDuet-ΔHsFBXO28-Myc-MBP-HA（P74719）

该载体以pACYCDuet-1双表达骨架为基础，克隆缺失F-box结构域的突变体ΔHsFBXO28（C端Myc标签），携带氯霉素（Chl）抗性元件。

缺失F-box结构域的FBXO28无法与SKP1结合组装SCF复合物，丧失泛素连接酶活性，在研究中作为阴性对照，验证自泛素化依赖完整F-box结构域。

该载体是人源SCF^FBXO28泛素化研究的对照质粒，用于验证反应的结构依赖性。

推荐感受态：BL21，培养温度37℃，适合开展泛素化机制验证、蛋白功能域研究。

共享的价值与意义

将经过高水平研究验证的成熟载体通过开放平台共享，能够让好的科研工具跨实验室流动，减少重复构建载体的时间与资源消耗，也为相关领域的同行提供经过验证的可靠工具，共同提升研究效率。课题组选择将质粒分享至淼灵质粒平台，既是对平台标准化质检体系与专业服务的认可，也是对科研资源开放共享理念的践行。

淼灵科研质粒共享计划

淼灵质粒平台长期推行科研质粒共享计划，面向全国高校、科研院所的课题组开放，接收各类经过实验验证的质粒载体分享。平台将对提交的质粒完成序列核验、纯度质检等标准化流程，收录至平台现货库并统一对外展示，助力科研资源的高效流转与开放共享。

如果您所在课题组有已验证的闲置质粒，希望分享给更多科研同行使用，欢迎联系平台工作人员提交载体信息，我们将全程协助完成质检、上架等全流程服务。