文献阅读 | The wheat and barley vernalization gene VRN3 is an orthologue of FT

Yan L, Fu D, Li C, Blechl A, Tranquilli G, Bonafede M, Sanchez A, Valarik M, Yasuda S, Dubcovsky J. The wheat and barley vernalization gene VRN3 is an orthologue of FT. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Dec 19;103(51):19581-6. doi: 10.1073/pnas.0607142103.

摘要：冬小麦和大麦品种需要长时间暴露在低温下，以加速开花（黄化），而春季品种没有这一需求。在本研究中，我们证明在这些物种中，春化基因VRN3与一个很像拟南芥FT（FLOWERING LOCUS T ）的基因完全连锁。叶子中的FT会诱导产生促进开花的可传播信号。分别记为HvFT和TaFT的大麦和小麦直系同源同源的转录水平，在具有显性Vrn3等位基因（早开花）的植物纯合子中显著高于纯合隐性的vrn3等位基因（晚开花）。在小麦中，显性Vrn3等位基因与插入TaFT启动子中的逆转录因子连锁；而在大麦中，HvFT第一个内含子的突变区分了具有显性和隐性VRN3等位基因的植物。通过转基因使TaFT等位基因携带启动子逆转录因子的冬小麦开花时间显著早于非转基因植物，这支持了TaFT和VRN-B3之间的一致性。对开花时间的统计分析证实，小麦和大麦的春化和FT等位基因类型间存在显著相互作用（P < 0.0001）。这些结果证实了小麦和大麦的FT基因是春化需要的自然等位基因变异的原因，为这些重要经济作物提供了额外的适应性多样性来源。

 

 

植物物种的繁殖和生存关键取决于其准确调节从营养生长到生殖生长过渡的能力。因此，植物进化出完善的机制，能够整合与季节性变化相关的光周期和春化（长期暴露在低温下）信号，以优化开花时间和种子生产。

光周期通路在开花植物中保存相对良好，CONSTANS基因（CO）发挥着核心调节作用。在长日（LD）植物拟南芥中，CO诱导花点T（FT）的转录，而在短日（SD）植物水稻中，CO抑制FT（水稻中分别称为Hd1和Hd3a）。FT在几个物种的转基因植物中的过度表达与早期开花有关，这表明该基因是开花的保守启动子。叶子中的FT诱导导致一个可传递的信号，通过韧皮部传播到顶端，在那里诱导开花。

与保守的光周期通路相反，拟南芥和温带禾草的春化通路的几个方面各不相同。在拟南芥中，MADS-box基因Flowering LOCUS C（FLC）在春化通路中发挥着核心作用。FLC通过抑制叶子中的FT和分生组织中的SOC1的产生来推迟开花，从而抑制FD转录因子的上调（FD转录因子与FT共同诱导开花）。春化永久下调了FLC，从而释放FT和SOC1的抑制，以诱导AP1的转录（AP1负责营养和生殖分生组织之间的过渡）。FLC受FRIGIDA（FRI）的正向调节，并由拟南芥自主开花途径中的基因负调节。令人惊讶的是，在温带禾草（如小麦和大麦）中没有发现FRI或FLC的明确同源物。

来自温带禾草的VRN2基因（与拟南芥VRN2不同）是开花的主要抑制剂，由春化和SDs调节。VRN2在拟南芥中没有密切的同源性，但在春化中的作用类似于FLC。在六倍体冬小麦品种Jagger中利用RNA干扰（RNAi）降低VRN2转录水平能够显著加速开花。VRN2具有CCT结构域（CO、类CO和TOC1），与CO相似。该结构域内的突变或完整的VRN2基因的缺失会得到二倍体小麦和大麦春季生长习惯的隐性等位基因，消除了春化要求。

小麦和大麦中VRN1春化基因启动子或第一内含子的突变，减少或消除了VRN2等位基因对开花时间的影响。这种开花的主要启动子是拟南芥分生组织特异基因AP1的直系同源。冬季小麦品种的VRN1转录水平被春化所上调，转基因小麦中采用RNAi下调其水平会导致延迟开花。

还存在另外两个春化基因已经在大麦（VRN-H3）和小麦（VRN-B4）中被报道。VRN-H3因其与形态标记BLP的松散联系而暂时被分配到1H染色体上，而VRN-B4被绘制在小麦7B号染色体的短臂上。我们在这里表明，VRN-H3基因实际上位于大麦染色体臂7HS上，与小麦春化基因VRN-B4直系同源（后称VRN-B3）。我们还表明，VRN3是拟南芥FT基因的直系同源。

结论

小麦VRN-B3的遗传图谱

通过利用中国春（CS）和外来染色体置换系CS(Hope7B)杂交产生的82个染色体重组置换系（RSLs），我们将VRN-B3定位到了7B染色体的短臂上、距离ABC158标记远端1cM、距离微卫星标记GWM569近端5cM的位置。ABC158序列（L43928）与水稻6号染色体上编码蛋白质BAD69198上的DNA序列90%相同。这个序列距离Hd3a近端50kb。Hd3a是造成水稻开花时间显著差异的基因，与拟南芥FT基因为直系同源。

由于FT是VRN-B3的潜在候选基因，我们使用已发表的大麦直系同源序列（HvFT，DQ100327）开发了小麦直系同源基因（TaFT）的标记。我们利用位于ABC158和Hd3a（AK121981）之间的一个水稻基因中开发了第二个标记，该标记被命名为UCW99。使用这些标记，我们将TaFT定位在与VRN-B3和UCW99完全连锁，并距ABC158远端1cM。通过分析每个关键RSL的10-11株植物的开花时间，以及侧翼标记ABC158和GWM569之间的重组事件，证实了VRN-B3和TaFT之间的完全连锁。

大麦VRN-H3的遗传图谱

我们利用BGS213（春性，Vrn-H3）和Hordeum vulgare subsp. spontaneum (C. Koch) Thell. （冬性，vrn-H3）杂交的F2群体定位了VRN-H3。之前在这个种群中发现的春性和冬性植物之间3:1的比例证实了单个显性基因的分离。该基因被定位在7H染色体上，与微卫星位点EBMAC0603和EBMATC0016连锁。为了探索VRN-H3与定位在小麦7B同源染色体上的春化基因之间的关系，我们为小麦中定位的相同基因开发了大麦标记。标记UCW99和HvFT彼此完全连锁，并与VRN-H3和ABC158远端1cM连锁。

携带BGS213 UCW99/HvFT等位基因的植株在播种后36至50天开花，而携带H. vulgare subsp. spontaneum UCW99/HvFT等位基因的植株在播种后85至111天开花，从而促进了VRN-H3的精确定位。通过使用春性遗传种群BGS213和冬性大麦品种“Igri”杂交构建的第二个大麦作图群体，证实了HvFT和VRN-H3之间的完全连锁。

为了排除BGS213基因种群出错的可能性，我们测试了另外两组VRN-H3近等基因系，其中Tammi（Vrn-H3）的春性生长习性通过11次回交被引入冬季品种Hayakiso 2和Dairokkaku 1。使用为HvFT开发的分子标记，我们确认两个春性Vrn-H3近等基因系具有Tami等位基因（与BGS213相同），而轮回的冬季亲本具有不同的HvFT等位基因。我们的结果表明，Vrn-H3位于7H染色体上，并与HvFT连锁，而不是最初因为与BLP的松散连锁而认为的在1H染色体上。

基于已知的大麦和小麦染色体之间的共线性，以及大麦VRN-H3和小麦VRN-B4之间的紧密连锁，这三个分子标记位于同源染色体组7（A和B）上。我们得出结论，这两个基因是直系同源的，并提议将小麦春化基因重新命名为VRN-B3。

大麦VRN-H3高密度遗传图谱和物理图谱

我们选择了大麦作图群体BGS213 × H. vulgare *subsp.*spontaneum来进行VRN3的高密度定位，因为它的二倍体遗传更简单，多态性相对于小麦种群更高。为了在该区间产生额外的标记，我们开发了几个与水稻基因Hd3a侧翼区间相对应的UCW标记。尽管该区域检测到大麦和水稻之间有70kb的倒位，但倒转中基因的共线性性促进了与HvFT密切相关的大麦标记的发展。

我们首先使用HvFT侧翼标记UCW98-UCW99来筛选来自该群体的1600个配子，并在目标区域内发现了12个具有重组事件的株系。这12个株系的后代测试用于将VRN-H3远端0.3cM处定位到UCW98、近端0.4cM到UCW99，并与HvFT完全连锁。

针对HvFT及其侧翼标记的大麦探针UCW98、UCW99、UCW116和UCW117被用于筛选“Morex”大麦BAC库。19个BAC通过指纹和杂交被回收和组装成三个由两个空隙分隔的contig。大麦BACs 440G4（DQ900686）、761F4（DQ900685）和455J22（DQ900687）的测序揭示了非共线大麦基因UCW118和水稻和大麦中的推定基因UCW120的存在。这两个大麦标记的映射进一步将VRN-H3的位置划分为0.2-cM的区间，两侧是UCW120和UCW118。在水稻共线28kb区域发现的唯一注释基因（不包括假设基因和重复元素）是Hd3a和Hd3b，这是FT的水稻直系同源。

同样，除了HvFT外，在三个大麦BAC中没有发现UCW120和UCW118之间的其他已知基因。为了测试其他基因是否与FT密切连锁，我们还对粗山羊草Coss. BAC HI41I11 (DQ899784)进行了测序，其包含一个HvFT的直系同源基因（PHRED ≥20时覆盖2.8倍）。在170kb的BAC中的80%显示了与重复元素的相似，而其余的与FT以外的已知基因没有相似之处（数据未显示）。基于这些结果，HvFT是我们VRN-H3的唯一候选基因。

使用HvFT作为探针的Southern blot分析得出了与大麦基因组DNA的单一杂交带，这表明水稻第6号染色体的Hd3a-Hd3b重复发生在与Triticeae的分化后，这一假设也得到了小麦、大麦、水稻和拟南芥中类似FT基因的系统发育分析的支持。

FT等位基因差异

TaFT和HvFT基因有三个外显子编码为177aa的蛋白质。相比之下，系统发育分析中包含的所有其他FT和类FT基因都有四个外显子。这种差异是由TaFT和HvFT中外显子3和4的融合产生的。

小麦

我们从CS（Hope7B）（DQ890165）和CS（DQ890162）对小麦TaFT基因及其侧翼5'和3'区域进行了亚克隆和测序。CS（Hope7B）上与早开花相关的等位基因（Vrn-B3）有一个5,295-bp的重复元件，从起始密码子上游插入591-bp，而CS上与晚开花相关的等位基因（vrn-B3）中没有这个插入。在启动子区域检测到另外六个单核苷酸多态性，在内含子1中的折叠元件中检测到三个单核苷酸多态性。在编码区域或停止密码子下游的前628 bp中，两个TaFT等位基因之间没有发现差异。

插入TaFT启动子的逆转录转座子具有相同的LTR，这表明近期发生了插入。小麦种质中插入的低频率进一步证实了这一点。除了Hope品种外，我们没有在19个四倍体春小麦、29个六倍体冬小麦和77个六倍体春小麦的集合中发现这种逆转录转座子插入。这些结果表明，这种突变尚未在商业品种中广泛使用，因此，这是调节小麦开花时间的遗传多样性的潜在宝贵来源。

大麦

与Vrn-H3连锁的、BGS213（DQ898515）中的HvFT等位基因与Igri（DQ898517）和H. vulgare subsp. spontaneum（DQ898516）中与vrn-H3相关的等位基因不同，在起始密码子上游的前550bp中由九个连锁多态性（7个SNP和两个indel）并在第一个内含子中的两个连锁多态性。

我们从另外七个冬性品种（隐性vrn-H3）中测序了HvFT，并发现了启动子单倍型的异质性。启动子单倍型在两个品种中与Igri相似，在其他五个品种中与BGS213相似。这些结果表明，BGS213启动子单倍型不足以确定占主导地位的春季生长习惯。然而，当存在来自其他春化基因的春性生长习性等位基因时，我们不能排除这种启动子多态性对开花时间的影响。冈山大学的种质调查显示，所有携带Vrn-H3等位基因的品种也具有显性Vrn-H1等位基因。

在第一个内含子中发现的单倍型与观察到的生长习惯差异更为一致。所有冬季品种在第一个内含子中都表现出与Igri和H. vulgare subsp. spontaneum相同的单倍型，这与携带显性Vrn-H3等位基因的品种不同。这些结果表明，第一内含子中的区域可能在通过春化调节HvFT中发挥重要作用。以前的报告也支持了这种可能性，这些报告表明FLC与FT第一内含子中的一个区域结合，这对拟南芥中该基因的调节至关重要。我们正在开发几个分离群体，以评估HvFT启动子和第一内含子多态性在决定不同大麦遗传背景开花时间方面的作用。

FT表达模式

通过定量PCR分析了从作图群体中选择的20种不同的F3植物的HvFT转录水平，这包括10种携带纯合BGS213 HvFT等位基因和10种携带纯合H. vulgare subsp. spontaneum等位基因的植株。与携带H. vulgare subsp. spontaneum等位基因相比，携带BGS213 HvFT等位基因的三叶阶段植物的HvFT转录水平（P < 0.01）明显更高，这种差异在接下来的几周里，在绿色植物和非绿色植物中都持续存在。

在小麦中也观察到类似的结果。携带Hope TaFT等位基因的RSL与携带CS等位基因相比，显示出TaFT转录水平的显著升高（P < 0.01）。由于FT诱导其他植物物种开花，这些结果表明，携带显性Vrn3等位基因的株系的早开花可能因为与携带vrn3等位基因的株系相比FT转录水平更高。

具有纯合显性Vrn-H3等位基因的春性植株随着发育显示出HvFT转录物的迅速增加。然而，在没有春化的情况下，携带隐性vrn-H3的冬季植物表现出较低的HvFT转录水平。经过六周的春化，冬性植物的HvFT转录水平明显高于非春化植物（P = 0.002）。Triticum monococcum L. 冬性材料 G3116也证实了通过春化对FT转录水平的上调作用。

在短日下，HvFT转录水平非常低，当植物转移到LD时，HvFT转录水平会上调，这表明光周期对HvFT转录水平有强烈影响。以前在大麦中也报告了类似的观察结果。

HvFT转录模式与VRN-H1的转录模式密切相关，确认了这些基因之间的已知相互作用。与HvFT和VRN-H1观察到的趋势相反，冬性植物的VRN-H2转录水平因春化而降低。在春性植物中，即使没有春化，VRN-H2水平也很低，可能是由于VRN1转录水平较高的结果。先前的研究表明，VRN1直接或间接地下调了VRN2。

利用Hope TaFT等位基因改造冬小麦

在所有作图群体中，FT和VRN3之间的完全遗传遗传连锁、以及FT调控区域内的多态性、FT转录水平和开花时间之间的对应关系，都表明FT实际上是VRN3。为了确认FT和VRN3之间的身份，我们利用Hope的显性TaFT等位基因对冬小麦品种Jagger进行了转基因，Hope携带逆转座子插入。图中给出了转化实验中使用的结构中克隆的Hope TaFT区域的示意图。

我们分析了两个独立的转基因事件，包括每个转化事件的六到七个T1转基因植物和八或九个非转基因控制。在LD下生长的五叶龄未春化植株中提取叶RNA样本。用Hope等位基因转化的Jagger植株显示，TaFT转录物水平比非转基因对照高出80倍。转基因株的平均开花时间是春性株系的典型开花时间（播种后40±1天和51±2天），而非转基因植物一直处于营养阶段，直到播种后110天实验结束。将冬小麦品种转换为春季小麦品种支持了FT和VRN-3之间的身份。

FT和春化的相互作用

在小麦和大麦中，使用春化处理和FT等位基因类型作为因子，开花时间的ANOVA分析显示了非常显著的相互作用（P < 0.0001）。经过春化的小麦和大麦植株在两种VRN3等位基因类型植株的开花时间差异小于未春化的植物。基于这些结果和观察到的通过春化对FT转录水平进行上调，我们得出结论，在温带谷物中，FT与春化途径相互作用。

在拟南芥中，到目前为止，还没有描述春化要求的自然变化与FT之间的联系。然而，FT（或TSF）的过度表达强烈抑制了FLC介导的冬季年度拟南芥加入的晚花表型，而不影响FLC mRNA水平。这表明FT和/或TSF的激活可以绕过FLC创建的开花阻碍，从而确认FT在FLC下游发挥作用。这里报道了小麦的类似结果，转基因冬性品种Jagger中TaFT的表达量增加绕过了VRN2抑制，导致春季生长习惯。

为了测试小麦中春化和FT之间的相互作用是否与温带谷物特有的春化基因VRN2的存在有关，我们研究了T. monococcum近等基因系中FT的转录水平，这些转录水平在VRN2等位基因中有所不同。春性材料Dv92具有由CCT结构域中的点突变产生的隐性vrn2等位基因，而冬性材料G3116具有有功能的Vrn-2等位基因。在近等基因系的的五叶期，没有发现VRN2转录水平（P>0.05）的显著差异。相比之下，在同一发育阶段，携带Dv92突变vrn2等位基因的近等基因系中的FT转录水平比在同一发育阶段携带显性Vrn2等位基因的近等基因系高170倍（P < 0.05）。

这一结果表明，VRN2直接或间接地调节FT的定量水平，为温带谷物的春化路径和FT提供了联系。这种遗传相互作用并非完全出人意料，因为VRN2中的CCT结构域与CO有关，CO被证明与FT转录水平的调节有关。很容易猜测，这项研究中描述的FT调控区域的等位基因差异可能是FT和VRN2（或VRN2调节的基因）之间相互作用的中断及其对春化处理的不同反应的原因。图4中给出了一个总结VRN1、VRN2和VRN3之间相互作用的暂定模型。

根据该模型，VRN2是因春化和短日照而下调开花的抑制子，后者直接或间接地对VRN3和VRN1进行负调控。VRN3是长日照调节开花的启动子，长日照正向调节分生体身份基因VRN1。作为参考文献16和17中描述的反馈调节循环的一部分，VRN1转录物增加的次要影响是VRN2的下调。在长日照下生长的未春化的冬性植物表现出高水平的VRN2转录物和低水平的VRN1和VRN3。长日照下的春化导致VRN2的下调以及VRN3和VRN1的上调。在短日照下，所有三个基因的转录水平都较低，但当植物从短日转移到长日时，VRN1和VRN3会迅速上升调节。该模型还试图解释这三个基因之间观察到的强烈相互作用。隐性vrn2等位基因消除了VRN1和VRN3等位基因差异对开花时间的影响。我们认为，在没有功能性VRN2抑制剂的情况下，VRN1或VRN3中的不同突变调控区域对开花没有影响。众所周知，显性Vrn1和Vrn3等位基因减少或消除了VRN2等位基因差异对开花时间的影响。我们认为VRN1或VRN3调控区的突变足以阻止VRN2介导的抑制对其的识别，并启动开花级联反应。

 

总之，这项研究为小麦和大麦中的FT和VRN3之间的关系提供了强有力的证据。结果还表明，FT等位基因变异与开花时间的差异有关，并且FT等位基因变异与春化要求之间存在显著的交互作用。这种等位基因变异为这些具有重要经济意义的作物提供了适应性多样性的额外来源。

材料和方法

遗传和物理做图

S1附录第一节描述了在小麦和大麦做图群体的材料和标记。用于构建物理重叠群的大麦BAC和每个测过序的BAC序列覆盖度全部列表可在S1附录第二届得到。系统发育分析在附录S1的第三节。

等位基因差异

用于描述FT等位基因差异的材料的描述包含在S1附录第四节中。这包括一份测试TaFT启动子上是否存在逆转录转座子插入的小麦材料列表（S1表4）。Fredrickson × Stander杂交中做图发现的大麦染色体臂7HS上开花时间QTL也包括在本节中。

转录表达模式和转基因植物

表达实验中使用的材料和方法载于S1附录第五节。这些信息包括环境条件和定量PCR实验中使用的引物。转基因实验中使用的结构和程序详见S1附录第六节，而FT与春化之间相互作用的统计分析载于S1附录第七节。