实验步骤：ab197449 – Human Inflammation Antibody Array A (10 Targets) - Quantitative

人10种炎症因子检测试剂盒，可检测：POS1，POS2，IL-1α，IL-1β，IL-4，IL-6，IL-8，IL-10，IL-13，MCP-1，IFNγ，TNFα

1.实验准备

　　1.1. 准备试剂

1. Wash Buffer I  20× : 稀释成  1×
   
2. Wash Buffer II  20× : 稀释成  1×
3. 1X Human Inflammation Array A (10 T) Biotinylated Antibody Cocktail：加1.4ml 样品稀释剂，轻轻混匀；、
   
4. 1X Cy3 equivalent dye-conjugated streptavidin： 加1.4ml 样品稀释剂，轻轻混匀
5. 样品稀释剂：直接使用

　　1.2. 准备标准品

1. 使用前1h内配置冻干标准品，如果要分两天使用的话，配置好的标准品要放在-80℃；
   
2. 冻干标准品+500ul样品稀释剂，快速旋转颠倒使之混匀，做好标记：#1；
3. 给7个管子分别编号：#2，#3，…，#7，#8；
4. #2到#8每个管子加入200ul样品稀释剂；
5. 往#2中加入100ul #1，混合均匀；
6. 往#3中加入100ul 标准品#2，以此类推，连续稀释5次；
7. 往#8中加入100ul样品稀释剂，作为对照组（不能加标准品和样品）。

    

    

   稀释后不同炎症因子浓度：

    

    

    

　　1.3. 准备样品

1. 血清中含有很多细胞因子，尽量使用不含血清的培养基，如果使用了含血清的培养基，推荐把完全培养基作为对照组；
2. 加样推荐量：50-100ul血清或细胞培养上清液；
3. 必要时可以对样品进行稀释后再检测。

2.实验步骤

1. 往每个孔加入100ul样品稀释剂，室温孵育30min；
2. 去掉每孔的buffer，每孔加入100ul标准品或样品，室温孵育1-2h；
3. 如果每孔加入液体量＜70ul，建议在孵育时覆盖一层膜，防止液体蒸发；
4. 轻轻倒出样品，室温下用150ul 1× Wash Buffer I 洗5次，每次5min，每次清洗后均需完全移除Wash Buffer I；
5. 室温下用150ul 1× Wash Buffer II 洗2次，每次5min，每次清洗后均需完全移除Wash Buffer II；
6. 配置抗体：1.1 第3步；
7. 每孔加80ul配置好的检测抗体，室温孵育1-2h（也可4℃过夜孵育）；
8. 去掉每孔的抗体，室温下用150ul 1× Wash Buffer I 洗5次，每次5min，每次清洗后均需完全移除Wash Buffer I；
9. 室温下用150ul 1× Wash Buffer II 洗2次，每次5min，每次清洗后均需完全移除Wash Buffer II；
10. 配置结合Cy3荧光基团的链霉亲和素：1.1 第4步；
11. 每孔加80ul配置好的结合Cy3荧光基团的链霉亲和素，室温孵育1h，注意避光；
12. 去掉每孔的链霉亲和素，室温下用150ul 1× Wash Buffer I 洗5次，每次5min，每次清洗后均需完全移除Wash Buffer I；
13. 把玻璃板拆卸下来（注意不要触摸到表面），放在slide Washer/Dryer，加入30ml1X Wash Buffer I ，室温下轻轻晃动15min进行清洗。清洗完后移除Wash Buffer I ，加入30ml1X Wash Buffer II，室温下轻轻晃动5min进行清洗。
    
14. 完全移除残余缓冲液（1000rpm 3min离心；压缩的N2干燥；或用移液管吸走残余的缓冲液）；
15. 成像：通过配备有Cy3波长的激光扫描器进行成像。
16. 数据提取：GenePix, ScanArray Express, ArrayVision,or MicroVigene