文献阅读《A Novel Algorithm for Detecting Microsatellite Instability Based on Next-Generation Sequencing Data》

基于下一代测序数据的微卫星不稳定性检测新算法

A Novel Algorithm for Detecting Microsatellite Instability Based on Next-Generation Sequencing Data

Li S, Wang B, Chang M, Hou R, Tian G and Tong L (2022) A Novel Algorithm for Detecting Microsatellite Instability Based on Next-Generation Sequencing Data. Front. Oncol. 12:916379. doi: 10.3389/fonc.2022.916379

微卫星不稳定性(MSI)是由DNA复制过程中自发获得或丢失核苷酸引起的基因组突变。MSI在临床上已被发现是一种有用的免疫治疗生物标志物。基于DNA的MSI检测方法主要是聚合酶链反应(PCR)扩增和片段长度分析，成本高，耗时长。因此，作者开发了一种基于下一代测序(NGS)数据的检测MSI的新方法。
文章选择了6个MSI标记。在比对和计数之后，绘制了一个直方图，显示每个标记的不同长度的计数。然后，设计了一种算法来识别生成的直方图中的峰值，。
选取9个样本作为训练数据集，101个样本作为验证数据集，68个样本作为测试数据集，数据集来自内蒙古赤峰市医院。基于NGS的方法对验证数据集的准确率为100%，对测试数据集的准确率为98.53%，其中只检测到一个假阳性。结论:利用NGS数据可以获得准确的MSI判断，可以提供与金标准PCR方法相媲美的MSI检测方法。

样本构成

Table 1 [图片来源于原文]

文章一共纳入了176对Tumor-Blood配对的样本。所有样本的MSI状态都经过PCR和毛细血管电泳的方法进行确认。一共采用哦那个了6个marker的探针进行捕获，使用BOKE公司的探针，在MGI-2000平台测序。

测序数据可在NCBI网站获得：PRJNA810563

数据处理

1、测序数据比对获得bam文件

首先将测序下机的数据经过处理之后得到bam文件。(详细的处理可参考原文献)

2、获取深度数据识别peak

首先从bam文件提取位点的深度信息，获得每个MSI位点的depth。
接着根据获取的depth数据识别peak。

Figure 3A [图片来源于原文]

为了降低噪音避免出现假峰，设置一个阈值(如上图红色线所示)，只有depth大于阈值才被认为是一个真实存在的峰. 并且对峰的高度进行了标准化，用相对的高度来衡量。

第\(n\)个位置的相对高度定义为:

\[rh_n=\frac{h_n}{\sum_{i=1}^{n} h_i} \]

其中，\(N\)为检测到的峰总数，\(h\)为各峰的绝对高度。超参数\(R_h\)被设置为峰值的阈值。如果发现了一个峰，它的\(rh_n \geqslant R_h\)，那么这个峰就被认为是一个真正的峰;否则认为是技术噪声造成的假峰。这一步骤将有助于消除一些假峰。

其次，应用平滑步骤。平滑步骤是计算其邻域间平均高度的过程:

\[h_n=\frac{h_{n-1}+h_n+h_{n+1}}{3} \]

Figure 4 [图片来源于原文]

3、判断是否为unstable

识别peak之后，通过Tumor与Normal的比较，可以判断微卫星位点是稳定还是不稳定。如果Tumor与Normal中的peak个数不同，则判定为\(unstable\)。如果两种组织的peak个数相同，但Tumor与Normal峰位置的错位2bp则也认为是\(unstable\)。

参数优化

定义了一个参数 \(diff\) 来衡量NGS数据与PCR数据之间的差距，最小化 \(diff\) 来确定最优的参数。
使NGS数据与PCR数据之间的差距最小化，损失函数定义为:

\[diff=\frac{\sum_{i}^{S}\sum_{t}^{T}abs(P_{NGS}^{i,t}-P_{PCR}^{i,t})}{S} \]

其中\(S\)为样本总数，\(T\)为标记总数，\(P_{NGS}^{i,t}\)为算法在NGS数据中的第T个标记中发现的峰数，\(P_{PCR}^{i,t}\)为PCR数据中第T个标记中发现的第i个样本中的峰数。该损失函数可以评估每个样品NGS数据与PCR数据的平均峰差。
涉及到的参数有peak的阈值，是否平滑处理。设置peak阈值的寻优范围为0.1-3.0.步长为0.1。
最终确定peak阈值为0.2，平滑处理。

结果总结

在独立的68个样本数据集中，准确性：98.53%；敏感性：100%
使用相同的训练集、验证集和测试集分别测试该算法和MSIsensor的性能，MSIsensor阈值定为40%。两种算法的性能如图5所示：(A)该算法在验证集，(B)在验证集上的MSIsensor， (C)在测试集上的算法，(D)在测试集上的MSIsensor。

Figure 5 [图片来源于原文]

该算法，利用NGS数据来确定癌症患者的MSI状态，其准确性与基于PCR和毛细血管电泳的金标准方法相当。