CUT-TAG分析流程以及详细解读

CUT-TAG分析流程以及详细解读

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0.进入环境

source activate CUT-TAG

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1. Fastp: 数据质量控制

fastp -i sample1.fastq.gz -I sample2.fastq.gz -o sample1.clean.fastq.gz -O sample2.clean.fastq.gz -j sample.json

• -i: 输入的FASTQ文件（正向读取）。
• -I: 输入的FASTQ文件（反向读取）。
• -o: 输出的清理后的FASTQ文件（正向读取）。
• -O: 输出的清理后的FASTQ文件（反向读取）。
• -j: 质量控制统计的JSON报告文件。

统计所有数据原始测序量，Q20，Q30，及clean后的各项数据

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2. Bowtie2比对和Samtools处理

bowtie2 -p 30 --very-sensitive -X 2000 -x $bowtie2_index -1 sample_1.fq.gz -2 sample_2.fq.gz | samtools sort -O bam -@ 5 -o sample.raw.bam
samtools index sample.raw.bam
samtools flagstat sample.raw.bam

• -p 30: 使用30个线程进行比对。
• --very-sensitive: 使用非常敏感的比对模式。
• -X 2000: 配对读取的最大插入片段长度为2000 bp。
• -x: 参考索引前缀。
• -1, -2: 配对端读取的输入FASTQ文件。
• samtools sort: 对SAM/BAM文件进行排序。
• -@ 5: 使用5个线程进行排序。
• samtools index: 为BAM文件创建索引。
• samtools flagstat: 报告BAM文件的统计信息。

此处统计数据比对率，去重前数据量

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3. 使用Sambamba标记重复

sambamba1 markdup --overflow-list-size 600000 --tmpdir='./' -r sample.raw.bam sample.rmdup.bam
samtools index sample.rmdup.bam
samtools flagstat sample.rmdup.state

• --overflow-list-size 600000: 处理溢出记录的列表大小。
• --tmpdir='./': 临时文件目录。
• -r: 标记重复并创建新的BAM文件（sample.rmdup.bam）。
• samtools index: 为去重后的BAM文件创建索引。
• samtools flagstat: 报告去重后的BAM文件的统计信息。

此处统计去重后数据量，根据raw.bam数据量计算重复率

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4. 过滤和排序BAM文件

samtools view -h -f 2 -q 30 sample.rmdup.bam | grep -v chrM | samtools sort -O bam -@ 5 -o sample.last.bam
samtools index sample.last.bam
samtools flagstat sample.last.bam > sample.last.state

• -h: 包括头信息。
• -f 2: 仅包含正确配对的读取。
• -q 30: 过滤掉映射质量低于30的读取。
• grep -v chrM: 排除映射到线粒体染色体（chrM）的读取。
• samtools sort: 对过滤后的BAM文件进行排序。
• -@ 5: 使用5个线程进行排序。
• samtools index: 为最终排序的BAM文件创建索引。
• samtools flagstat: 报告最终BAM文件的统计信息。

此处统计fragments数，相当于过滤后剩余多少对reads

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5. 生成BigWig文件

bamCoverage --bam sample.last.bam -o sample.bw --binSize 10 --extendReads --normalizeUsing RPKM

• --bam: 输入的BAM文件。
• -o: 输出的BigWig文件。
• --binSize 10: BigWig文件中分割的bin的大小。
• --extendReads: 扩展读取用于计算覆盖度。
• --normalizeUsing RPKM: 每个bins中read counts的校正单位，使用RPKM（每百万读取的转录本每千碱基对）进行归一化。

生成bw文件，要和peak文件共同可视化

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6. 峰值调用

STARR-seq:

macs2 callpeak -t sample -c input.last.bam -g 2728702538 -p 0.01 -f BAMPE -B --SPMR --keep-dup=all -n sample --outdir ./ 

CHIP/ CUT&TAG/ATAC:

macs2 callpeak -t sample -g 2728702538 -p 0.01 --nomodel --shift -75 --extsize 150 -B --SPMR --keep-dup all --call-summits -n sample --outdir ./ 

• -t: 输入的BAM文件（实验样本）。
• -c: 对照组的BAM文件（如有）。
• -g 2728702538: 有效基因组的大小（通常为基因组的总长度，单位为碱基对）。
• -p 0.01: 显著性水平（p值阈值）。
• -f BAMPE: 输入格式为配对端BAM。
• --nomodel: 不建立模型。
• --shift -75: 读取向左移动75 bp。
• --extsize 150: 扩展读取到150 bp。
• -B: 生成峰值文件。是否输出bedgraph格式的文件。以bedGraph格式存放fragment pileup, control lambda, -log10pvalue和log10qvalue。
• --SPMR: 将bedGraph文件中的读数转化为每百万reads的比率。
• --keep-dup all: 保留所有重复的读取。
• --call-summits: MACS利用此参数重新分析信号谱，解析每个peak中包含的subpeak。对相似的结合推荐使用此参数，当使用此参数时，输出的subpeak会有相同的peak边界，不同的绩点和peak summit poisitions.
• -n sample: 输出文件的前缀名称。
• --outdir ./: 输出目录。

-c 放input数据 --keep-dup all 前一步已经去重了这里要保证不去重

获得narrowpeak文件后与bw一起放入IGV，看call peak对不对

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