卡梅德生物｜羊驼 VHH 纳米抗体文库构建，实验流程与质控要点

羊驼 VHH 纳米抗体属于重链可变区单域抗体，凭借分子量小、特异性强、稳定性好等特点，在诊断试剂、分子检测以及基础科研领域得到较多应用。噬菌体展示文库是获取纳米抗体的核心载体，免疫文库抗原富集效果较好，是科研工作中常用类型，下面简述文库构建的关键实验流程。

动物免疫与 PBMC 分离制备

构建免疫文库首先开展羊驼免疫实验，选用健康成年羊驼进行多点皮下注射，整体免疫周期 8‑10 周，共完成 5‑6 次免疫。首次免疫搭配完全弗氏佐剂，后续加强免疫更换不完全弗氏佐剂。待血清 ELISA 效价达标后采集外周血液，利用 Ficoll 密度梯度离心法分离 PBMC 单个核细胞，用于后续核酸提取。

核酸提取与 VHH 基因扩增

处理 PBMC 样本需要在低温无酶环境下提取总 RNA，防止 RNA 发生降解。RNA 检测合格后逆转录合成 cDNA，通过两轮巢式 PCR 特异性扩增 VHH 基因，得到约 400bp 的目的片段。扩增产物经琼脂糖电泳验证后做凝胶回收纯化，去除非特异性杂带，得到纯度合格的目的基因片段，用于载体连接。

载体连接与噬菌体文库制备保存

选择适配 TG1 菌株的噬菌体展示载体，完成载体线性化处理。按照合适的摩尔配比，将 VHH 目的片段和载体进行连接或同源重组。重组产物通过电转化导入感受态细胞，复苏后梯度涂布平板统计菌落，计算文库库容。加入辅助噬菌体进行超感染，PEG‑NaCl 沉淀浓缩噬菌体文库，分装置于‑80℃条件保存。

文库质控与实验风险提示

文库构建完成后需要做多维度质控，包含库容统计、菌落 PCR 检测重组率、测序评估序列多样性、测定噬菌体滴度。RNA 降解、电转化效率不足、PCR 循环数过多，均会降低文库质量，实验全程需要做好无酶低温、标准化电击等操作，规避各类实验风险。

完成构建的文库，可开展固相、液相、细胞水平淘选，筛选不同靶点的纳米抗体。卡梅德生物可以提供羊驼纳米抗体文库构建相关技术服务，助力科研人员完成抗体方向课题。