实验方案

实验方案全文

去泛素化酶USP25通过去泛素化稳定转铁蛋白受体TFRC促进帕金森病模型中多巴胺能神经元铁死亡

一、科学背景与研究假设

帕金森病（Parkinson‘s disease， PD）的主要病理特征为中脑黑质致密部多巴胺能神经元进行性丢失。全基因组关联研究（GWAS）已鉴定USP25基因座变异（如rs2823357）与散发性PD风险显著关联（Nalls et al.， 2019）。同时，PD患者黑质存在显著铁沉积，且铁死亡（ferroptosis）被证实是驱动该区域神经元死亡的关键形式（Do Van et al.， 2016）。转铁蛋白受体1（TFRC）是细胞摄取铁离子的主要通道，其蛋白表达上调可导致胞内不稳定铁池扩大并敏化铁死亡（Gao et al.， 2016）。去泛素化酶USP25虽已发现参与先天免疫调控，但其在铁代谢及铁死亡中的作用完全未知。我们初步提出科学假设：USP25通过与TFRC结合并移除其泛素链，增强TFRC蛋白稳定性，进而促进MPP+诱导的多巴胺能神经元铁死亡。

二、实验材料

1. 细胞系

• 人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞，购自ATCC (CRL-2266)，用含10%胎牛血清（FBS， Gibco 10099-141）的DMEM/F12培养基（Gibco 11330-032）在37°C、5% CO₂下培养。

2. 主要质粒

• pCMV-Flag-USP25：人USP25 cDNA全长（NCBI参考序列：NM_001321290.1）经PCR扩增后，克隆至pCMV-Flag-2载体（Clontech， 635623）的BamHI/XhoI位点。构建由通用生物公司完成并测序验证。
• pCMV-Flag-USP25 C178S（催化失活突变体）：以上述野生型质粒为模板，采用点突变试剂盒（Toyobo， KOD-Plus-Mutagenesis Kit）引入C178S突变，引物为F：5‘-TCCCTTCAGCCAGTCCGGGCAC-3’； R：5‘-GTCCGGGCACACCCACGTAA-3’（序列按载体实际设计），测序确认。
• pCMV-HA-TFRC：人TFRC cDNA全长（NCBI参考序列：NM_003234.3）克隆至pCMV-HA载体（Clontech， 631604）的EcoRI/NotI位点。
• pCMV-HA-Ubiquitin（HA-Ub）：购自Addgene (#18712)。
• 空载体对照：pCMV-Flag、pCMV-HA。

3. siRNA

• ON-TARGETplus Human USP25 siRNA SMARTpool（Dharmacon， L-006072-00-0005），包含靶向USP25的四种siRNA混合物。
• ON-TARGETplus Human TFRC siRNA SMARTpool（Dharmacon， L-010294-00-0005）。
• ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool（阴性对照siNC， Dharmacon， D-001810-10-05）。
• 工作浓度：转染时终浓度50 nM。

4. 主要抗体

抗体	货号（供应商）	用途及稀释比
Anti-USP25 (D5O4Y) 兔单抗	CST 11848	WB 1:1000
Anti-TFRC (D7G9X) 兔单抗	CST 13113	WB 1:1000， IP 2 μg/次
Anti-Flag M2 鼠单抗	Sigma F1804	WB 1:2000， IP 2 μg
Anti-HA-Tag (C29F4) 兔单抗	CST 3724	WB 1:1000
Anti-Ubiquitin (P4D1) 鼠单抗	CST 3936	WB 1:1000
Anti-GPX4 (EPNCIR144) 兔单抗	Abcam ab125066	WB 1:2000
Anti-TH 兔多抗	Sigma T1299	WB 1:5000
Anti-β-Actin (13E5) 兔单抗	CST 4970	WB 1:5000
正常兔IgG	CST 2729	用于IP阴性对照

5. 关键试剂

• MPP+碘化物：Sigma D048；用PBS配成100 mM母液，-20°C避光保存，工作浓度1 mM。
• Ferrostatin-1：Sigma SML0583；DMSO配成10 mM母液，工作浓度1 μM。
• 全反式维甲酸（RA）：Sigma R2625；DMSO配成10 mM母液，-20°C避光，工作浓度10 μM。
• 放线菌酮（CHX）：Sigma C7698；DMSO配成50 mg/mL母液，工作浓度50 μg/mL。
• MG132：Selleck S2619；DMSO配成20 mM母液，工作浓度10 μM。
• Lipofectamine 3000转染试剂：Invitrogen L3000015。
• FerroOrange：Dojindo F374；用HBSS配成1 mM母液，工作浓度1 μM，现配现用。
• C11-BODIPY⁵⁸¹/⁵⁹¹：Invitrogen D3861；DMSO配成10 mM母液，工作浓度2 μM。
• CCK-8试剂盒：碧云天 C0037。
• GSH和GSSG检测试剂盒：碧云天 S0053。
• 细胞裂解液（Co-IP用）：50 mM Tris-HCl (pH 7.4)， 150 mM NaCl， 1 mM EDTA， 1% Triton X-100，临用前加入1 mM PMSF、1×蛋白酶抑制剂复合物（Roche， 04693116001）及20 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM， Sigma E3876，抑制去泛素化酶）。
• 变性裂解液（泛素化实验用）：含2% SDS， 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)， 10 mM DTT的缓冲液，煮沸后稀释10倍再用常规IP裂解液进行IP。

三、实验方法与步骤

（一）细胞分化与PD铁死亡模型的建立

目的：获得具有多巴胺能特征的神经元模型，并确定后续实验的MPP+损伤浓度。

1. SH-SY5Y分化
   • 细胞接种于培养皿，生长至50%融合时，更换为分化培养基（含1% FBS的DMEM/F12 + 10 μM RA），每2天换液一次，连续处理6天[¹]。
   • 分化完成后，细胞呈现明显神经突触样结构，用于后续实验。
2. MPP+浓度梯度与铁死亡验证
   • 分化后的SH-SY5Y细胞铺96孔板（8000细胞/孔）。
   • 设置MPP+浓度：0， 0.25， 0.5， 1， 2 mM，每组6复孔。
   • 处理24h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37°C孵育1h，450 nm测定吸光度。计算细胞活力百分比（相对于0 mM对照组）。
   • 铁死亡特异性抑制验证：在1 mM MPP+处理同时，加入Fer-1（1 μM），以确认细胞死亡可被铁死亡抑制剂部分挽救。选择导致细胞活力下降约50%的1 mM MPP+处理24 h作为后续建模条件[²,³]。

（二）蛋白相互作用检测（免疫共沉淀，Co-IP）

目的：验证USP25与TFRC在细胞内存在物理结合。

1. 外源性Co-IP
   • 于10 cm皿中接种分化后的SH-SY5Y细胞，使用Lipofectamine 3000共转染Flag-USP25 (5 μg) 与 HA-TFRC (5 μg)，同时设单独转染Flag-空载体与HA-TFRC组作为阴性对照。
   • 转染48h后，吸去培养基，用预冷PBS洗2次。
   • 每皿加800 μL含NEM的Co-IP裂解液，冰上裂解30 min，4°C 12000 g离心15 min，收集上清。
   • 取50 μL上清作为Input，加入等体积2×SDS上样缓冲液，煮样5 min。
   • 余下裂解液等分为两份，分别加入2 μg Anti-Flag M2抗体或2 μg正常IgG，4°C旋转孵育过夜。
   • 每管加入40 μL预洗的Protein A/G琼脂糖珠（Santa Cruz sc-2003），4°C孵育2 h。
   • 用冷裂解液洗珠5次，每次5 min。最后一次吸干，加入40 μL 2×上样缓冲液煮沸5 min。
   • WB：用Anti-HA抗体检测被Flag-USP25拉下的HA-TFRC；用Anti-Flag验证IP效率。
2. 内源性Co-IP
   • 不经转染，直接收集分化后SH-SY5Y细胞裂解液。用Anti-TFRC抗体(2 μg)和对照IgG进行IP，WB用Anti-USP25检测。

（三）USP25对TFRC蛋白稳定性的影响（CHASE实验）

目的：直接测定USP25是否延长TFRC蛋白半衰期。

1. 在6孔板中分化SH-SY5Y细胞，转染siNC或siUSP25 (50 nM) ，或过表达组转染Flag-USP25 (2 μg) 与对照空载体。每组设3个复孔。
2. 转染48h后，吸去旧培养基，换为含放线菌酮（CHX， 50 μg/mL）的完全培养基。
3. 分别在加入CHX后0， 1， 2， 4， 6小时，吸掉一个孔的培养基，用PBS快速洗一次，加入150 μL 1×SDS上样缓冲液直接裂解细胞并刮下，煮沸10 min。
4. 等量蛋白进行WB，检测TFRC蛋白条带。以β-actin为内参，用ImageJ定量条带灰度值，以0h的TFRC/β-actin比值为100%绘制降解曲线。

（四）USP25对TFRC泛素化水平的调控

目的：获得USP25去除TFRC泛素链的直接生化证据，并确定其活性位点依赖性。

1. 于6 cm皿中分化SH-SY5Y细胞，分组转染：
   (a) Flag-空载 + HA-Ub (2 μg)；
   (b) Flag-USP25 WT + HA-Ub；
   (c) Flag-USP25 C178S + HA-Ub；
   (d) siNC + HA-Ub；
   (e) siUSP25 + HA-Ub。
   各组均补充空载体至总DNA量一致。
2. 转染42h后，加入MG132 (10 μM) 处理6h。
3. 变性IP（排除蛋白间非特异性结合）：
   • 收集细胞，用含2% SDS的变性裂解液（50 mM Tris-HCl pH 7.5， 2% SDS， 10 mM DTT）100 μL裂解，煮沸10 min。
   • 加入900 μL常规Co-IP裂解液（不含SDS）充分稀释，超声剪切DNA。
   • 4°C 12000 g离心10 min，取上清，加入2 μg Anti-TFRC抗体，4°C旋转过夜。后续加Protein A/G珠、洗涤操作同Co-IP。
4. WB：用Anti-Ub抗体（检测高分子弥散状泛素信号）和Anti-TFRC抗体（检测沉淀效率）检测。

（五）USP25-TFRC轴对PD细胞模型铁死亡表型的调控

目的：在MPP+损伤模型下验证USP25通过TFRC促进铁死亡。

实验分组（所有分组均使用分化后的SH-SY5Y细胞）：

组别	预处理（转染24h）	损伤处理（后续24h）
1. 空白对照	空载体 + siNC	等体积PBS
2. 模型组	空载体 + siNC	MPP+ (1 mM)
3. 抑制验证组	空载体 + siNC	MPP+ + Fer-1 (1 μM)
4. USP25保护组	siUSP25	MPP+
5. USP25加重组	Flag-USP25	MPP+
6. 催化失活组	Flag-USP25 C178S	MPP+
7. 挽救组1	Flag-USP25 + siTFRC (50 nM)	MPP+
8. 挽救组2	Flag-USP25	MPP+ + Fer-1

检测指标：

1. 细胞活力：CCK-8法，操作同前。
2. 脂质过氧化检测（C11-BODIPY）
   • 细胞处理结束后，用无血清培养基洗一遍，加入含2 μM C11-BODIPY⁵⁸¹/⁵⁹¹的培养基，37°C避光孵育30 min。
   • PBS洗2次，胰酶消化收集细胞，用400 μL PBS重悬。
   • 立即流式细胞仪检测：激发波长488 nm，检测氧化型荧光（FITC通道，530/30 nm），获取10000个细胞，分析平均荧光强度（MFI）[⁴]。
3. 胞内亚铁离子检测（FerroOrange）
   • 处理后的贴壁细胞，用HBSS洗一次，加入1 μM FerroOrange探针工作液，37°C避光孵育30 min。
   • 荧光显微镜拍照（Ex/Em = 543/580 nm），或用胰酶消化后流式细胞仪PE通道检测，以对照组为基准计算相对荧光强度。
4. GSH含量检测
   • 细胞处理完成后，胰酶消化，PBS洗一次。按碧云天GSH/GSSG试剂盒说明操作：每10⁶细胞用蛋白去除试剂S溶液反复冻融裂解，离心取上清。一部分直接测总谷胱甘肽，另一部分先加GSSG清除辅助液处理再测GSSG。通过DTNB循环反应法，在412 nm测定吸收值，计算GSH含量及GSH/GSSG比值。
5. 关键蛋白免疫印迹检测
   • 收集各组细胞，RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂）裂解，BCA法定量蛋白。
   • 等量蛋白上样SDS-PAGE，转膜，5%脱脂牛奶封闭1h。
   • 分别孵育一抗：Anti-GPX4 (1:2000)、Anti-TFRC (1:1000)、Anti-TH (1:5000)、Anti-Flag (1:2000)、Anti-USP25 (1:1000)、Anti-β-actin (1:5000)，4°C过夜。
   • TBST洗3次，HRP二抗室温1h，ECL显影。以β-actin为内参定量。

（六）统计方法

所有实验独立重复3次，数据以均值±标准差表示。两组间比较采用Student’s t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后用Tukey法进行多重比较。p < 0.05为差异有统计学意义。统计图使用GraphPad Prism 8绘制。

四、预期结果

1. Co-IP：在Flag-USP25 + HA-TFRC共转染组，Anti-Flag抗体能特异性地共沉淀HA-TFRC，而IgG组为阴性。内源Co-IP中，TFRC抗体能拉下USP25条带。证实二者存在相互作用。
2. CHASE实验：过表达USP25显著减缓TFRC蛋白降解（半衰期从约4h延长至>6h），而敲低USP25则明显加速其降解（半衰期缩短至2h以内）。说明USP25提高TFRC蛋白稳定性。
3. 泛素化实验：野生型USP25过表达显著降低TFRC的多聚泛素化信号，而C178S突变体及USP25敲低则使TFRC泛素化水平明显升高。证明USP25以催化活性依赖方式去泛素化TFRC。
4. 铁死亡表型：
   • 模型组（MPP+）细胞活力下降约50%，伴随脂质ROS升高、胞内亚铁积累、GSH耗竭及GPX4下调，这些均能被Fer-1显著逆转，确认铁死亡发生。
   • USP25敲低：细胞活力显著回升，脂质过氧化、铁蓄积减轻，GPX4表达部分恢复，TH蛋白保留。
   • USP25过表达：加剧上述所有铁死亡指标恶化，TH蛋白丢失更严重。
   • C178S突变体过表达：无法加重损伤，表型与对照组类似，证明USP25的促铁死亡作用依赖其去泛素化酶活性。
   • 挽救实验：共转siTFRC或加入Fer-1，均可显著逆转USP25过表达造成的细胞死亡加剧和脂质过氧化，表明TFRC是USP25促铁死亡的关键下游执行分子。

预期代表性图表：Co-IP免疫印迹图、TFRC降解时间曲线、TFRC泛素化阶梯状条带、C11-BODIPY流式直方图与统计、GPX4/TH/TFRC表达WB图及定量柱状图。

五、参考文献（真实可查）

1. Encinas M, Iglesias M, Liu Y, et al. Sequential treatment of SH-SY5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neurotrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J Neurochem. 2000;75(3):991-1003.
2. Gomez-Santos C, Ferrer I, Santidrian AF, et al. Dopamine induces autophagic cell death and α-synuclein increase in human neuroblastoma SH-SY5Y cells. J Neurochem. 2002;81(4):686-695. (MPP+ 1mM使用依据)
3. Dixon SJ, Lemberg KM, Lamprecht MR, et al. Ferroptosis: an iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 2012;149(5):1060-1072. (Fer-1使用浓度)
4. Sun X, Ou Z, Chen R, et al. Activation of the p62-Keap1-NRF2 pathway protects against ferroptosis in hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 2016;63(1):173-184. (C11-BODIPY使用方法)
5. Nalls MA, Blauwendraat C, Vallerga CL, et al. Identification of novel risk loci, causal insights, and heritable risk for Parkinson’s disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet Neurol. 2019;18(12):1091-1102.
6. Gao M, Monian P, Pan Q, et al. Ferroptosis is an autophagic cell death process. Cell Res. 2016;26(9):1021-1032. (TFRC与铁死亡)
7. Do Van B, Gouel F, Jonneaux A, et al. Ferroptosis, a newly characterized form of cell death, in Parkinson’s disease that is regulated by PKC. Cell Death Dis. 2016;7(11):e2301.