ATCC 9372 萎缩芽孢杆菌：干热灭菌与环氧乙烷灭菌验证生物指示剂的标准菌株

关键词：ATCC 9372、萎缩芽孢杆菌、干热灭菌验证、环氧乙烷灭菌验证、生物指示剂、ISO 11138-4、ISO 11138-5、EPA消毒验证

一、菌株基本信息

  • ATCC编号：9372
  • 菌种名称：萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus）
  • 原始编号：NRS 1221A
  • 分离来源：自然环境
  • 革兰氏反应：阳性（G+）
  • 形态：杆菌，可形成耐热芽孢
  • 生物安全等级：BSL-1（非致病性）
  • 基因组测序：已完成全基因组测序
  • 保藏机构：ATCC（美国典型培养物保藏中心）
  • 历史命名：曾用名Bacillus subtilis var. niger（枯草芽孢杆菌黑色变种）、Bacillus globigii

命名变更说明： ATCC 9372的分类经历了多次修订：Bacillus subtilis var. niger → Bacillus globigii → Bacillus atrophaeus。当前ATCC官网采用的正式名称为Bacillus atrophaeus。国内部分文献仍使用"枯草芽孢杆菌黑色变种"或"BG孢子"的旧称。

二、标准中的定位

ATCC 9372 是干热灭菌和环氧乙烷灭菌验证的核心生物指示剂菌株，在以下标准中被明确指定：

2.1 国际标准

  • ISO 11138-4:2017：（灭菌用生物指示剂——第4部分：干热灭菌用生物指示剂）：指定Bacillus atrophaeus（或B. subtilis 5230）为干热灭菌BI标准微生物
  • ISO 11138-5:2017：（灭菌用生物指示剂——第5部分：低温蒸汽甲醛灭菌用生物指示剂）：参考菌株

2.2 美国标准

  • USP <55>：Biological Indicators—Resistance Performance Tests：干热灭菌和EO灭菌BI参考
  • EPA法规：消毒剂效能验证中指定Bacillus atrophaeus ATCC 9372作为孢子态挑战微生物
  • ASTM E2197：定量载体试验方法指定该菌株

2.3 中国标准

  • GMP规范：灭菌验证推荐使用
  • GB 15981-1995：《消毒与灭菌效果的评价方法与标准》：干热灭菌效果评价参考

2.4 生物指示剂技术参数

依据ISO 11138-4标准，ATCC 9372作为干热灭菌BI的核心参数：

  • 参数：标准要求（干热灭菌）
  • 灭菌工艺：干热灭菌
  • 标准灭菌温度：160℃
  • 孢子数量：≥1×10⁶ CFU/载体
  • D₁₆₀值：≥2.5分钟（ISO 11138-4规定）
  • 典型D₁₆₀值：2.5~5.0分钟
  • 存活时间：≥10分钟（160℃条件下）
  • 杀灭时间：≤30分钟（160℃条件下）

对于环氧乙烷灭菌：

  • 参数：参考要求（EO灭菌）
  • 灭菌工艺：环氧乙烷气体灭菌
  • 典型D值：2.5~6.0分钟（600mg/L EO，54℃，RH60%）
  • 孢子数量：≥1×10⁶ CFU/载体

三、灭菌验证中的应用要点

3.1 干热灭菌验证

ATCC 9372是干热灭菌（160℃及以上温度）验证的首选生物指示剂：

  1. 常用灭菌参数：

    • 160℃维持2h（经典干热灭菌条件）
    • 170℃维持1h
    • 180℃维持30min
    • 250℃维持45min（去内毒素干热灭菌）

  2. BI放置位置：最难灭菌的位置（干热柜的冷点区域、器械内部死角）

  3. 判读方法：

    • 灭菌后取出BI，将芽孢载体放入TSB培养基中
    • 3037℃培养4872h
    • 阳性（灭菌失败）：培养基浑浊
    • 阴性（灭菌成功）：培养基清亮

3.2 环氧乙烷灭菌验证

ATCC 9372也可用于EO灭菌验证，常用参数：

  • EO浓度：450~1200 mg/L
  • 温度：45~55℃
  • 相对湿度：40~80%
  • 灭菌时间：2~12h（依据D值和SAL计算）

3.3 EPA消毒验证中的孢子挑战试验

依据EPA法规，ATCC 9372芽孢是医院环境表面消毒剂注册验证的必测微生物：

  1. 载体试验：不锈钢载体表面涂布≥1×10⁶ ATCC 9372芽孢
  2. 消毒剂处理：按规定浓度和时间处理载体
  3. 中和+回收：使用中和剂回收存活芽孢
  4. 判定标准：杀灭对数值≥3（99.9%杀灭率）为合格

3.4 D值测定

ATCC 9372的D值测定：

  • 干热D值：在160℃恒温条件下暴露不同时间，存活曲线法计算D₁₆₀
  • EO D值：在标准EO条件下（如600mg/L EO, 54℃, RH60%）暴露不同时间计算
  • D值必须由BI制造商标明：，用户使用前应确认

3.5 灭菌验证方案设计

与ATCC 7953湿热灭菌验证类似，干热/EO灭菌验证包括：

  1. 物理验证：温度分布、气体浓度分布
  2. 生物验证：ATCC 9372 BI覆盖最难灭菌位置
  3. 半周期验证：证明灭菌量充足
  4. 全周期验证：确认灭菌成功

四、培养与保藏技术要点

4.1 常规培养条件

  • 培养基：TSB/TSA（培养繁殖体）、芽孢培养基（制备芽孢）
  • 培养温度：30~37℃（繁殖体生长）
  • 培养时间：24~48h
  • 气体条件：兼性厌氧，常规大气

注意：ATCC 9372的繁殖体培养温度为30~37℃，与ATCC 7953（55~60℃）截然不同。判读BI时用37℃培养。

4.2 芽孢制备与计数

制备ATCC 9372芽孢悬液用于自定义BI或EPA验证：

  1. 在芽孢培养基上3037℃培养57天
  2. 收集芽孢，用无菌水洗涤
  3. 加热80℃10min杀灭繁殖体（保留芽孢存活）
  4. 平板计数确认芽孢浓度≥1×10⁶ CFU/mL
  5. 芽孢悬液储存于2~8℃，可长期稳定

4.3 菌种保藏

  • 芽孢保存：2~8℃无菌水或乙醇中，芽孢可长期稳定
  • 繁殖体短期保藏：TSA斜面，2~8℃，每月传代
  • 长期保藏：-80℃甘油冻存（繁殖体）；芽孢形式保存更稳定

4.4 形态鉴别要点

  • 30~37℃培养后菌落圆形、光滑、白色至淡黄色
  • 革兰染色阳性杆菌
  • 芽孢椭圆形，中央或近端位
  • 关键特征：形成黑色色素（旧名"黑色变种"由来），但在某些培养基上色素不明显
  • 37℃生长良好（区别于ATCC 7953的55℃嗜热生长）

五、常见问题与排障

  • 干热灭菌BI假阳性：灭菌温度不达标或时间不足
  • 芽孢计数偏低：芽孢制备条件不当或繁殖体残留干扰
  • EPA载体试验杀灭率不足：消毒剂接触时间不够或中和剂无效
  • EO灭菌BI假阳性：EO浓度或湿度不够
  • 培养后BI不浑浊（阳性对照也不浑浊）：培养温度错误（用了55~60℃）

六、权威数据来源

  • ATCC官方目录：https://www.atcc.org/products/9372
  • ISO 11138-4:2017 Sterilization of health care products — Biological indicators — Part 4: Biological indicators for dry heat sterilization
  • ISO 11138-5:2017 Biological indicators for low-temperature steam and formaldehyde sterilization
  • USP <55> Biological Indicators—Resistance Performance Tests
  • EPA Registration Guidelines for Disinfectants
  • ASTM E2197 Standard Quantitative Carrier Test Method
  • Mesa Labs Spore Strips for Dry Heat Sterilization

关于我们

杭州康氧医疗器械有限公司专注于ATCC标准菌株、ATCC细胞、DSMZ标准菌株、CMCC菌种、CICC菌种等各类微生物标准菌株的供应。我们的菌株直接源自ATCC官方保藏中心，特性稳定、数据权威可溯源，广泛应用于制药、食品、化妆品、环保及科研领域的质量控制与检测验证。

  • 官网：www.kystrains.com

免责声明

本文内容基于ATCC官方数据、USP标准、ISO标准及EPA法规整理，仅供专业技术交流参考，不构成任何商业推荐或采购建议。灭菌验证属于法规性操作，应严格按照USP/ISO/GMP/EPA现行版完整条文执行。D值和BI参数应以制造商标注值为准。特别提醒：ATCC 9372的分类名称已从Bacillus subtilis var. niger更新为Bacillus atrophaeus，部分国内文献仍用旧名，实际操作应以ATCC官网最新命名为准。

posted @ 2026-08-10 16:40  杭州康氧医疗器械  阅读(0)  评论(0)    收藏  举报