易基因：mBio：ChIP-seq助力揭示AcP依赖性乙酰化修饰网络对放线菌c-di-AMP稳态的调控机制|项目文章
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近日，华东理工大学生物工程学院和生物反应器工程国家重点实验室叶邦策教授和尤迪副教授为共同通讯作者、符瑜博士为第一作者在微生物学领域著名期刊《mBio》上发表题为《A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria》的科研成果。研究通过ChIP-seq等分析揭示乙酰磷酸（Acetyl Phosphate, AcP）依赖的乙酰化修饰网络在放线菌（Actinobacteria）中调控环二腺苷酸单磷酸（cyclic di-adenosine monophosphate，c-di-AMP）稳态的分子机制。研究以红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea，S. erythraea）为模型，揭示AcP通过乙酰化修饰影响两种关键蛋白：二腺苷酸环化酶（Diadenylate Cyclase, DisA）和其转录抑制因子DasR，从而调控c-di-AMP合成与降解，维持细胞内c-di-AMP稳态。其调控机制在放线菌中高度保守，并可能对细胞的生长、发育和抗生素合成产生重要影响。易基因科技为本研究提供ChIP-seq技术服务。
标题：A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria（乙酰磷酸依赖的修饰网络调控放线菌中c-di-AMP稳态）
发表时间：2024-07-09
发表期刊：mBio
影响因子：IF6.4/Q1
技术平台：ChIP-seq等（易基因金牌技术）
本研究提出一个由乙酰磷酸（AcP）调控的网络，该网络通过DisA和DasR这两个不同的底物来负责c-di-AMP稳态。研究揭示了AcP诱导的乙酰化通过破坏蛋白质多聚体化来调控，从而通过DisA的K66位点乙酰化抑制c-di-AMP合成；而DasR的K78位点乙酰化则消除对disA的转录抑制。研究验证了AcP通过介导平衡c-di-AMP稳态发挥关键生理作用。进一步的研究表明，乙酰化的DisA和DasR发生了构象变化，这些变化在分化过程中发挥着至关重要的作用。鉴于AcP诱导的乙酰化在响应环境胁迫时的广泛分布以及所鉴定关键位点的高度保守性，研究人员提出c-di-AMP稳态调控可能是放线菌中心回路的一个基本特性，从而实现对细胞生理的整体调控。
易小结
c-di-AMP是一种在细菌中广泛存在的核苷酸第二信使，参与调控细胞壁完整性、渗透压平衡、生物膜形成等多种生物学过程。易基因参与的前期研究揭示了c-di-AMP与红色糖多孢菌（放线菌模式菌株）中GlcNAc信号之间的直接联系，并阐明蛋白质酰基化与c-di-GMP协同调控放线菌发育与抗生素合成机制的研究进展。
详见：
项目文章 | Nature子刊：ChIP-seq等揭示c-di-AMP与DasR互作以调控细菌生长、发育和抗生素合成
项目文章 | NAR：ChIP-seq等揭示蛋白质酰基化与c-di-GMP协同调控放线菌发育与抗生素合成机制
本研究再次突破，通过ChIP-seq等分析揭示了AcP依赖的乙酰化修饰网络对c-di-AMP稳态的调控机制，为理解放线菌的生长发育、抗生素合成以及环境适应机制提供了新视角，为开发新型抗菌药物和优化抗生素生产菌株奠定理论基础。
研究要点
c-di-AMP鉴定对于细菌生长和细胞生理是必需的，因此本研究的主要挑战是细胞信号和刺激如何进入决定c-di-AMP浓度的决策过程，以及这些信息如何整合到调控通路中。研究以S. erythraea为模型验证了AcP依赖的DisA乙酰化及其转录抑制因子DasR参与协调环境信号和细胞内信号，这对于c-di-AMP稳态至关重要。
具体而言，DisA的K66位点乙酰化直接失活其二腺苷酸环化酶活性，从而抑制c-di-AMP产生，而DasR的K78位点乙酰化则导致disA表达增加和c-di-AMP水平升高。因此，AcP是c-di-AMP维持中的一个关键分子开关，它响应环境变化，可能抑制有效发育。因此，AcP介导的翻译后修饰（PTM）构成了合成酶/水解酶调控c-di-AMP稳态的网络。
乙酰磷酸（AcP）调控c-di-AMP稳态通路示意图
研究方法
蛋白质乙酰化状态检测：通过免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）和免疫印迹（Immunoblotting, IB）分析检测DisA和DasR的乙酰化水平。
体外乙酰化实验：利用AcP对DisA和DasR进行体外乙酰化反应，验证其乙酰化位点。
质谱分析（LC-MS/MS）：鉴定乙酰化修饰的位点，确定DisA的K66和DasR的K78为关键乙酰化位点。
酶活性检测：通过酶活性实验检测乙酰化对DisA二腺苷酸环化酶（DAC）活性的影响。
基因转录分析：利用实时定量RT-PCR（Real-time RT-PCR）检测disA基因的转录水平。
染色质免疫沉淀测序（Chromatin Immunoprecipitation Sequencing, ChIP-seq）：分析DasR在基因组上的结合位点，验证其对disA基因的转录调控。
生物物理实验：圆二色光谱（Circular Dichroism, CD）分析、化学交联实验和生物层干涉（Biolayer Interferometry, BLI）实验，研究乙酰化对蛋白结构和DNA结合能力的影响。
细胞生理实验：通过扫描电子显微镜（SEM）观察不同突变株的发育表型。
结果图形
（1）AcP依赖的乙酰化直接抑制DisA的DAC活性
研究发现，在氮限制条件下，DisA乙酰化水平显著升高，且AcP能够直接乙酰化DisA。体外实验表明，乙酰化DisA的DAC活性降低约75%，表明AcP依赖的乙酰化显著抑制了DisA的酶活性。进一步的质谱分析鉴定出DisA的K66为关键乙酰化位点，位于其DAC结构域内，该位点乙酰化导致DisA八聚体结构解离，从而抑制其DAC活性，减少c-di-AMP合成。
图1：AcP诱导的DisA乙酰化抑制其DAC活性。
- 在氮充足（N+）或氮限制（N-）条件下，S. erythraea野生型（WT）菌株的DisA乙酰化水平。
- 在37°C下，使用10 mM AcP对His标签的DisA蛋白进行不同时间点（0、1、3和5h）的乙酰化处理。通过Western blotting使用特异性抗乙酰赖氨酸（anti-AcK）抗体检测乙酰化水平。
- DisA野生型（DisAWT）和乙酰化DisA（DisAAcP）蛋白的DAC活性。
- DisAWT和DisAAcP蛋白的圆二色光谱（CD）图。
- DisA的结构域组织以不同颜色的方框表示。
- DisAWT、DisAAcP、DisAK66Q和DisAK66R蛋白的交联实验。
- DisAWT、DisAK66Q和DisAK66R蛋白的DAC活性。
（2）DisA主要在K66位点乙酰化时失活
通过构建DisA的K66突变体（K66Q和K66R），研究发现K66Q突变体的八聚体结构显著减少，DAC活性亦显著降低，而K66R突变体表现出与野生型相似活性。这表明K66位点乙酰化是DisA失活的主要原因。此外，过表达DisAK66Q的菌株中c-di-AMP水平显著降低，进一步验证K66乙酰化对c-di-AMP合成的抑制作用。
图2：K66乙酰化对体内c-di-AMP合成的影响。
- S. erythraea野生型（WT）、过表达DisAWT（OdisAWT）、过表达DisAK66Q（OdisAK66Q）和过表达DisAK66R（OdisAK66R）菌株在30°C下TSB培养基中培养的生长曲线。
- 在TSB培养基中培养的WT、OdisAWT、OdisAK66Q和OdisAK66R菌株中disA基因的转录水平。
- 在TSB培养基中培养的WT、OdisAWT、OdisAK66Q和OdisAK66R菌株的细胞提取物中细胞内的c-di-AMP水平。
（3）AcP依赖的乙酰化通过失活DasR消除对disA的转录调控
研究发现，DasR是disA基因的转录抑制因子，而AcP能够乙酰化DasR并影响其功能。在氮限制条件下，DasR乙酰化水平显著升高，且AcP能够直接乙酰化DasR。乙酰化使DasR的DNA结合能力显著减弱，从而消除对disA的转录抑制，导致c-di-AMP水平升高。
图3：AcP诱导的DasR乙酰化阻断其DNA结合活性。
- 在氮充足（N+）或氮限制（N-）条件下，S. erythraea WT菌株中DasR乙酰化水平。
- 在37°C下，使用10 mM AcP对His标签的DasR蛋白不同时间点（0、1、3和5h）乙酰化处理。通过Western blotting使用特异性抗乙酰赖氨酸（anti-AcK）抗体检测乙酰化水平。
- DasR野生型（DasRWT）和乙酰化DasR（DasRAcP）与目标基因disA启动子的结合电泳迁移率变化分析（EMSA）。
- DasR野生型（DasRWT）和乙酰化DasR（DasRAcP）蛋白的圆二色光谱（CD）图。
- DasR的结构域组织以不同颜色的方框表示。
- DasR及其突变体与目标基因disA启动子的结合EMSA分析。
- 纯化的His-DasR、DasRAcP、DasRK78Q和DasRK78R与disA基因启动子的结合BLI实验。
- DasR及其突变体的交联实验。
（4）DasR的K78位点乙酰化促进disA转录和c-di-AMP合成
质谱分析鉴定出DasR的K78为关键乙酰化位点。通过构建DasR的K78突变体（K78Q和K78R），研究发现K78Q突变体的DNA结合能力显著减弱，而K78R突变体则表现出与野生型相似的活性。ChIP-seq分析显示，K78乙酰化显著降低了DasR在disA启动子区域的结合能力，从而消除对disA的转录抑制，促进c-di-AMP的合成。
图4：K78乙酰化在体内消除DasR介导的对disA的抑制作用。
- ChIP-seq信号密度在peaks中心和转录起始位点（±2 kb）热图。显示了平均信号强度。红色表示信号强度低，蓝色表示信号强度高。
- 指定菌株中的ChIP-seq信号。
- 在指定菌株中，disA启动子区域的ChIP-seq信号的整合基因组浏览器（IGV）轨迹。
- 指定菌株中disA的转录水平。倍数变化表示与DasR野生型（DasRWT）菌株相比的表达水平。
- 指定菌株中细胞内的c-di-AMP水平。
（5）c-di-AMP稳态介导多细胞分化
研究发现，c-di-AMP水平变化对S. erythraea菌发育和孢子形成具有显著影响。过表达DisAK66Q的菌株表现出延迟的孢子形成，而过表达DisAK66R菌株则表现出过度孢子形成。这表明c-di-AMP水平升高促进了孢子形成，而K66位点乙酰化则抑制这一过程。此外，DasR的K78乙酰化也通过调控c-di-AMP水平影响孢子形成。
图5：AcP诱导的乙酰化影响孢子形成。
S. erythraea野生型（WT）、过表达DisAK66Q（OdisAK66Q）、过表达DisAK66R（OdisAK66R）、过表达DasRK78Q（OdasRK78Q）和过表达DasRK78R（OdasRK78R）菌株在30°C下于R2YE agar上培养96小时后的扫描电子显微照片。图像放大倍数为×5000。两次重复实验中结果相似的代表性图片。
（6）AcP与c-di-AMP稳态之间的生理联系保守
通过序列比对分析，研究发现DisA的K66和DasR的K78位点在多种放线菌中高度保守。这表明AcP依赖的乙酰化调控c-di-AMP稳态的机制在放线菌中具有广泛的保守性，可能对放线菌的生长发育和抗生素合成具有普遍的调控作用。
图6：放线菌中DasR和DisA蛋白的序列比对。
对以下物种的DisA（A）和DasR（B）蛋白序列进行了比对：青链霉菌（Streptomyces lividans）、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）、阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）、灰色链霉菌（Streptomyces griseus）、委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）、红孢链霉菌（Streptosporangium roseum）、热单胞菌（Thermomonospora curvata）以及红色糖多孢菌（S. erythraea）。所有物种中保守的赖氨酸残基以红色加粗显示。
讨论
本研究揭示了AcP依赖的乙酰化修饰网络在调控c-di-AMP稳态中的重要作用。AcP通过乙酰化修饰DisA和DasR，直接或间接调控c-di-AMP的合成与降解。这种调控机制不仅在红色糖多孢菌中存在，还在其他放线菌中具有广泛的保守性。此外，c-di-AMP水平的变化对细菌的生长发育和抗生素合成具有显著影响，表明c-di-AMP稳态调控对于放线菌的生理功能至关重要。未来的研究可以进一步探索AcP依赖的乙酰化修饰在其他细菌中的作用机制，以及如何通过调控c-di-AMP稳态来优化抗生素生产菌株。
ChIP-seq在本研究中的重要作用
本研究通过ChIP-seq分析，研究者精确地定位DasR在基因组上的结合位点，验证了DasR对disA基因的直接转录调控。此外，ChIP-seq数据还揭示了AcP依赖的乙酰化如何通过影响DasR的DNA结合能力来调控c-di-AMP合成，为研究c-di-AMP稳态的分子机制提供重要依据。
关于易基因染色质免疫共沉淀测序 (ChIP-seq)
染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究体内蛋白质与DNA相互作用的经典方法。将ChIP与高通量测序技术相结合的ChIP-Seq技术，可在全基因组范围对特定蛋白的DNA结合位点进行高效而准确的筛选与鉴定，为研究的深入开展打下基础。
DNA与蛋白质的相互作用与基因的转录、染色质的空间构型和构象密切相关。运用组蛋白特定修饰的特异性抗体或DNA结合蛋白或转录因子特异性抗体富集与其结合的DNA片段，并进行纯化和文库构建，然后进行高通量测序，通过将获得的数据与参考基因组精确比对，研究人员可获得全基因组范围内某种修饰类型的特定组蛋白或转录因子与基因组DNA序列之间的关系，也可对多个样品进行差异比较。
应用方向：
ChIP 用来在空间上和时间上不同蛋白沿基因或基因组定位
- 转录因子和辅因子结合作用
- 复制因子和 DNA 修复蛋白
- 组蛋白修饰和变异组蛋白
技术优势：
- 物种范围广：细胞、动物组织、植物组织、细菌微生物多物种富集经验；
- 微量建库：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展开测序分析；
- 方案灵活：根据不同的项目需求，选择不同的组蛋白修饰特异性抗体。
技术路线：
易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化、cfDNA）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G、ac4C、RNA与蛋白互作）、DNA与蛋白互作及染色质开放性技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900。
参考文献：Fu Y, Zhao L-C, Shen J-L, Zhou S-Y, Yin B-C, Ye B-C, You D. A network of acetyl phosphate-dependent modification modulates c-di-AMP homeostasis in Actinobacteria. mBio. 2024 Jul 9:e0141124. doi: 10.1128/mbio.01411-24.
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