易基因：MeRIP-seq揭示m6A修饰在肺动脉高压(PAH)发病机制中的潜在作用和新治疗靶点｜项目文章
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肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension， PAH）是一种不可逆的心血管疾病，其特征是肺血管阻力进行性增加，最终导致肺动脉高压和右心衰竭。PAH主要成因包括血管收缩、肺血管重塑和细胞外基质（ECM）沉积。肺血管重塑主要由肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的过度增殖和抗凋亡能力引起。PAH是一种涉及遗传、环境和表观遗传等多种因素的复杂疾病。表观遗传变化在血管重塑中的发病机制已被证实，但关于逆转PAH的特定表观遗传靶点的了解仍然有限。
N6-甲基腺苷（m6A）是一种丰富的内源性化学修饰，对RNA的剪接、翻译、定位和稳定性起着关键作用。m6A的动态和可逆性由甲基转移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）和不同的m6A结合蛋白（readers）调控。已有研究表明，m6A调控因子的表达失衡与多种生物过程功能障碍有关，包括凋亡/增殖、发育异常、肿瘤进展、自我更新能力降低和免疫系统异常。尽管有证据表明m6A酶失调参与了PAH发病机制，但m6A调控因子在PAH中的具体作用尚未明确。
2024年2月4日，中南大学湘雅二医院凤一路博士为第一作者、宋洁为通讯作者在《Biomedicines》杂志发表题为“Transcriptome-Wide N6-Methyladenosine Alternations in Pulmonary Arteries of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Rats and Novel Therapeutic Targets”的研究论文，文章通过甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq）和RNA转录组测序（RNA-seq）方法，分析单克隆素（MCT）诱导的PAH大鼠模型和对照组肺动脉组织中的mRNA表达和m6A位点变化，通过GO和KEGG通路富集分析进一步分析差异表达基因的功能。探讨了m6A调控因子表达及其在调控PASMC生物学行为中的作用，以揭示潜在的分子机制。
研究摘要：
本研究利用MeRIP-seq和RNA-seq研究对照组和野百合碱（monocrotaline）诱导的PAH大鼠肺动脉组织中m6A和RNA表达差异。使用GO和KEGG进行功能富集分析，研究了差异表达功能。为了筛选候选m6A相关基因，使用STRING和Metascape数据库构建了蛋白质-蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）网络，并通过对候选相关基因表达进行实时PCR验证。使用免疫组化染色、免疫荧光和Western blot技术进一步研究了m6A调控因子的表达水平，并对大鼠肺动脉平滑肌细胞（PASMC）进行增殖实验。研究共鉴定出42个差异表达基因，这些基因的m6A甲基化水平表现出增加或减少（高甲基化或低甲基化）。主要与细胞外基质结构、MAPK和PI3K/AKT通路相关。在PAH组中检测到候选基因着丝粒蛋白F（CENPF）表达增加。研究首次鉴定出一种富含亮氨酸的五肽重复序列（LRPPRC）的m6A reader，该reader在PAH大鼠模型中表达下调。体外实验中，siRNA介导的Lrpprc下调导致大鼠PASMC增殖增强和Cenpf mRNA表达升高。本研究结果揭示了PAH大鼠肺动脉中转录组范围的m6A修饰图谱变化和相关调控机制，可能为未来治疗策略提供新的靶点。深圳市易基因科技为本研究提供MeRIP-seq和RNA-seq技术服务。
研究思路：
研究结果
（1）PAH大鼠模型的m6A基本特征
图1： PAH大鼠模型的m6A基本特征。组织来自肺动脉，每组n=3。
- 维恩图显示了两组中m6A peaks（左）和基因（右）的重叠。
- 饼图显示了转录本四个不重叠区域（（5' UTR、CDS、3' UTR和其他区域）的m6A peaks百分比。
- 密度曲线显示m6A peaks在转录本中的分布。转录本分为三部分，即5'UTR、CDS和3'UTR。
- 两组不同数量m6A peaks的基因比例。
- 两组RRACH motif情况。
m6A：N6-甲基腺苷；PAH：肺动脉高压；MCT：野百合碱；UTR：非翻译区；CDS：编码序列。
（2）PAH中的差异m6A分析
图2：PAH中的差异m6A分析。
- 相对于对照组，MCT组中差异表达的m6A peaks火山图（| log2 FC |>0.585，p<0.05）。
- 差异m6A peaks中富集的前五个motif。
- 具有差异m6A的上调m6A标记的转录本GO分析。
- 具有差异m6A的下调m6A标记的转录本GO分析。
- 具有差异m6A的上调m6A标记的转录本KEGG分析。
- 具有差异m6A的下调m6A标记的转录本KEGG分析。
FC：倍数变化；GO：基因本体论；KEGG：京都基因与基因组百科全书。
表1：差异甲基化m6A peaks和相关基因数
（3）m6A修饰基因的转录谱
图3：m6A修饰基因的转录谱。
- 差异表达基因的火山图。
- 具有显著变化的peak差异表达基因的四象限图。
- 总体m6A与mRNA表达水平呈正相关（r=0.1517793，p＜0.05）。
D-E. GO和KEGG分析分别具有显著变化peak的差异表达基因。
F-G. 两个数据集的DEG分布的火山图。红点代表上调DEG，蓝点代表下调DEG，黑点代表非DEG。
H. 在两个数据集中同时上调的DEG。
- 在两个数据集中同时下调的DEG。DEG：差异表达基因。
表2：数据库中基因的mRNA表达水平（Log2（FC））
（4）PPI网络建立和候选基因鉴定
图4：蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络建立和候选基因鉴定。
A–C. 基于上述基因构建的中枢网络。
D. MCT组和对照组（每组n=6）肺组织中Cenpf的相对mRNA表达，数据代表平均值±SEM，并使用Student t检验比较两组组间差异。
E. 血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB）刺激（30 ng/mL）下，大鼠PASMC中Cenpf mRNA相对表达水平（每组n=3），以α-Tublin作为内部对照归一化。
F. 人类PASMCs在PDGF-BB刺激下的CENPF mRNA相对表达水平（每组n=3），以GAPDH作为内部对照归一化。
G. 用siRNA转染人PASMC 48h后，经PDGF-BB（30 ng/mL）再处理24h的CENPF mRNA相对表达水平（每组n=3）。
H-I. 以α-Tublin作为内部对照的PCNA蛋白水平的代表性Western blot和定量分析（每组n=3）。
J. 通过IGV观察到Cenpf mRNA转录本上的m6A水平。
PPI：蛋白质-蛋白质互作；SEM：平均值的标准误差；PASMCs：肺动脉平滑肌细胞；PDGF-BB：血小板衍生生长因子BB。
（5）肺动脉高压（PAH）的肺动脉中，leucine-rich pentatricopeptide repeat-containing (LRPPRC) 蛋白表达水平下降
图5： PAH患者的肺动脉LRPPRC表达降低。
- 两组（PAH和对照组）中23个m6A调控因子的表达情况热图。
- 肺组织中LRPPRC的免疫组化染色（每组n=6），条形图=100µm（左图），放大的肺动脉（右图）。
- 肺组织中LRPPRC的免疫荧光染色（每组n=6），血管染色图像（绿色）、目标蛋白染色图像（红色）、细胞核染色图像（蓝色），合并图像（橙色），条形图=50µm。
D-E. MCT和对照组肺组织中LRPPRC和α-Tubulin的代表性Western blot和定量分析（每组n=6）；数据表示为均值±标准误（SEM），使用学生t检验比较两组。
F-G. 大鼠PASMCs在PDGF-BB刺激下的LRPPRC水平的代表性Western blot和定量分析（30 ng/mL），以α-Tubulin作为内部对照（每组n=3）。
H. 在PDGF-BB刺激下（30 ng/mL），人类PASMCs中LRPPRC相对mRNA表达水平，以GAPDH作为内部对照（每组n=3）。
表3：m6A调控因子的mRNA表达水平
（6）LRPPRC下调促进PASMC增殖和Cenpf表达
图6：LRPPRC下调促进肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的增殖和Cenpf表达。
A.在PASMCs中，用siRNA转染PASMC 48小时，然后用PDGF-BB（30 ng/mL）再处理24小时后，Lrpprc水平的相对mRNA表达（每组n=3）。
B-C. 代表性的Western blot和PCNA水平的定量分析，以α-Tubulin作为内部对照归一化（每组n=3）。
- EdU掺入实验评估si-Lrpprc处理的PASMCs在PDGF-BB刺激下的细胞增殖能力。条形图=100µm。目标细胞为红色。
E.计算EdU染色的细胞比率。
F. Cenpf水平的相对mRNA表达（每组n=3）。
关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术
易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。
大样本量m6A-QTL性状关联分析，传统MeRIP单个样品价格高，通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术，显著提成IP平行性，实现不同样本间相对定量，降低检测成本。
易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术：
- m6A甲基化-常量mRNA 甲基化测序（MeRIP-seq）
- m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序（lnc-MeRIP-seq）
- m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
- 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化测序（MeRIP-seq2）
技术优势：
- 起始量低：样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需1μg总RNA；
- 转录组范围内：可以同时检测mRNA和lncRNA；
- 样本要求：可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测；
- 重复性高：IP富集重复性高，最大化降低抗体富集偏差；
- 应用范围广：广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域。
研究方向：
m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究
- 疾病发生发展：肿瘤、代谢疾病（如肥胖/糖尿病）、神经和精神疾病（如阿尔兹海默症/抑郁症）、炎症…
- 发育和分化：早期胚胎发育、个体/组织/器官生长发育、干细胞分化与命运决定、衰老
- 环境暴露与响应：污染、抗逆、生活方式
关于m6A甲基化研究思路
（1）整体把握m6A甲基化图谱特征：m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析
（2）筛选具体差异m6A peak和基因：差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示
（3）m6A甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略
（4）进一步验证或后期试验
易基因提供全面的表观基因组和表观转录组研究解决方案，详询易基因：0755-28317900.
参考文献：
Feng Y, Yu Z, Tang M, Li J, Peng B, Juaiti M, Tang Y, Liang B, Ouyang M, Liu Q, Song J. Transcriptome-Wide N6-Methyladenosine Alternations in Pulmonary Arteries of Monocrotaline-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Rats and Novel Therapeutic Targets. Biomedicines. 2024 Feb 4;12(2) pii: biomedicines12020364. doi: 10.3390/biomedicines12020364. PubMed PMID: 38397966.
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