易基因：项目文章|Cancer Res/IF22.6：中南大学湘雅医院团队ChIP-seq等揭示头颈鳞癌铁死亡的表观遗传调控机制

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2026年1月，中南大学湘雅医院张叠阔博士为第一作者，刘勇研究员为通讯作者，在肿瘤学领域顶刊《Cancer Research》上发表题为“CRB2 Activates an Epigenetic Axis to Promote Ferroptosis in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma”的科研论文。研究通过染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）等表观基因组技术鉴定出CRB2是头颈鳞状细胞癌（HNSCC）中一种新的铁死亡表观遗传调控因子。易基因ChIP-seq助力揭示组蛋白修饰H4K20me2在CRB2促进铁死亡过程中的核心作用。

 

研究发现，CRB2能显著增强HNSCC细胞对铁死亡的敏感性。其核心分子机制为：CRB2通过抑制去泛素化酶USP7与组蛋白去甲基化酶LSD1亚型LSD1(E8A)互作，促进LSD1(E8A)泛素化降解，从而导致铁死亡抑制基因SLC7A11启动子区域的组蛋白H4第20位赖氨酸二甲基化（H4K20me2）水平升高，表观遗传抑制SLC7A11转录，最终通过抑制SLC7A11-GPX4信号轴来促进铁死亡，抑制肿瘤生长。该研究揭示了CRB2→抑制USP7-LSD1(E8A)互作→促进LSD1(E8A)降解→H4K20me2升高→SLC7A11启动子富集H4K20me2→表观遗传沉默SLC7A11→抑制SLC7A11-GPX4通路→诱导铁死亡这一全新的表观遗传调控轴，为HNSCC精准治疗提供了新的潜在靶点和策略。

英文标题：CRB2 Activates an Epigenetic Axis to Promote Ferroptosis in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

译文标题：CRB2通过激活表观遗传轴促进头颈部鳞状细胞癌铁死亡

发表时间：2026年1月2日

发表期刊：Cancer Research

影响因子：IF22.6/Q1

技术平台：RNA-seq、ChIP-seq、ChIP-qPCR等

作者单位：中南大学湘雅医院、中国医药大学、江苏省人民医院等

 

研究方法

（1）生物信息学分析

TCGA-HNSCC数据（n=499）GSVA分析、差异表达分析（edgeR/DESeq）、与Epifactors数据库交集、Kaplan-Meier预后分析，筛选出与预后良好相关的候选表观遗传调控基因，包括CRB2。

 

（2）细胞实验

HNSCC细胞系（Tu686、HN8、JHU011、SCC17B、SCC4、Fadu）培养；铁死亡诱导剂（erastin、RSL3、IKE）、抑制剂（Fer-1）凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK）、自噬抑制剂（3-methyladenine）以及蛋白酶体抑制剂（MG132）和蛋白合成抑制剂（Cycloheximide）处理；慢病毒/shRNA/siRNA转染。

 

（3）分子检测

qRT-PCR、Western blot、免疫共沉淀（IP）结合LC-MS/MS质谱分析。

 

（4）细胞功能与表型分析

CCK-8活力测定、BODIPY C11流式检测脂质ROS、GSH/GSSG检测、TEM电镜观察线粒体形态、SIM结构光照明显微镜观察铁死亡下线粒体的动态结构变化、免疫荧光分析CRB2与LSD1(E8A)在细胞内的共定位情况。

 

（5）表观基因组学分析

ChIP-seq：全基因组范围H4K20me2结合位点的鉴定和功能注释。

ChIP-qPCR：定量检测特定基因启动子区域的富集。

 

（6）双荧光素酶报告基因实验

评估CRB2对SLC7A11转录活性的影响。

 

（7）体内动物实验

裸鼠皮下移植瘤模型监测肿瘤体积和最终肿瘤重量，评估CRB2在体内对肿瘤生长和铁死亡的影响。

 

（8）临床样本分析

收集114例HNSCC患者的石蜡包埋组织样本和20例新鲜配对样本。通过免疫组化（IHC）染色评估CRB2、H4K20me2和SLC7A11蛋白表达水平。结合患者的临床病理特征和预后信息进行生存分析和多因素Cox回归分析，验证CRB2的临床相关性。

 

结果图形

（1）生物信息学鉴定CRB2为铁死亡的潜在表观遗传调控因子

研究团队基于TCGA-HNSCC数据筛选HNSCC中铁死亡的表观遗传调控因子（图1A），利用39个铁死亡核心基因进行GSVA分析，将样本分为FCI高/低组。差异表达基因与表观遗传基因取交集后发现19个差异表达的表观遗传调控因子（图1B），其中10个在肿瘤与正常组织间差异表达（图1C）。Kaplan-Meier分析进一步筛选出4个高表达预示良好预后的基因，包括CRB2（图1D）。用erastin和RSL3处理HN8和Fadu细胞后，仅CRB2的mRNA和蛋白水平显著升高且趋势一致（图1E-F），研究由此聚焦于CRB2。

图1：CRB2是铁死亡的潜在表观遗传修饰因子

 

（2）CRB2促进铁死亡并抑制HNSCC生长

研究团队分析了CRB2在不同HNSCC细胞系中的表达水平（图2A），并在CRB2低表达的Fadu细胞中过表达CRB2（图2B-C）。分析结果显示，过表达CRB2使Fadu细胞以剂量依赖性方式增强erastin敏感性，且IC50降低（图2D）。该效应可被铁死亡抑制剂Fer-1特异性逆转，但不受凋亡或自噬抑制剂影响（图2E-F），证实为铁死亡特异性。CRB2过表达还显著增加Erastin诱导的脂质过氧化（ROS水平升高）和GSH/GSSG降低（图2G-H），TEM显示线粒体皱缩、膜密度增高（图2I），SIM观察到经典铁死亡线粒体改变（图2J）。体内实验中，CRB2过表达显著增强IKE抗肿瘤效果（图2L-M）。这些结果共同证明CRB2在体外和体内均能促进HNSCC铁死亡并抑制肿瘤生长。

图2：CRB2促进铁凋亡并在体外和体内抑制HNSCC生长

 

（3）CRB2通过抑制SLC7A11-GPX4通路诱导铁死亡

为探究CRB2如何促进铁死亡，研究团队在CRB2过表达和对照Fadu细胞中进行转录组测序，共鉴定出623个差异表达基因（DEGs）。这些DEGs与259个已知的铁死亡调控基因取交集后，得到20个候选靶基因（图3C），GO/KEGG分析显示富集于核糖体、氧化磷酸化等通路。qPCR验证发现在Fadu和SCC4两种HNSCC细胞系中，仅SLC7A11的mRNA水平在CRB2过表达后显著下调（图3D）。Western blot和IHC结果一致表明，CRB2过表达能显著降低SLC7A11及其下游分子GPX4的蛋白水平，而其他主要铁死亡防御系统中的FSP1和DHODH蛋白水平无变化（图3E-F）。表明CRB2主要通过特异性抑制SLC7A11-GPX4信号通路来诱导HNSCC铁死亡。

图3：CRB2通过抑制SLC7A11-GPX4通路诱导铁死亡

 

（4）CRB2在SLC7A11启动子区域富集H4K20me2

已知酵母中的CRB2同源物可促进H4K20甲基化。研究团队验证这一发现在HNSCC中的保守性：CRB2过表达特异性增加HNSCC细胞和移植瘤中的H4K20me2水平，而不影响H4K20me1和H4K20me3（图4A-B）；敲低CRB2则降低H4K20me2水平并介导SLC7A11/GPX4上调（图4C）。

为探究H4K20me2是否直接调控SLC7A11，研究者对CRB2过表达的Fadu细胞进行H4K20me2的ChIP-seq（图S4A-D）。结果显示，H4K20me2富集的DNA片段中有63.37%位于启动子区域，且包含铁死亡相关基因SLC7A11。

ChIP-qPCR证实在CRB2过表达的细胞中，H4K20me2在SLC7A11启动子的特定区域的结合显著增强，而H4K20me1和H4K20me3则没有变化（图4D-E）。同时，这种调控未发生在GPX4启动子区域（图4F-G）。双荧光素酶报告基因实验也证实CRB2能抑制SLC7A11启动子的转录活性（图4H）。这些结果表明CRB2通过增加H4K20me2在启动子区的富集以表观遗传沉默SLC7A11表达。

 

图4：CRB2在SLC7A11启动子区富集H4K20me2

 

 

图S4：ChIP-seq+ChIP-qPCR揭示CRB2过表达差异性调控SLC7A11位点H4K20me2富集水平

 

（5）CRB2通过抑制LSD1(E8A)升高H4K20me2

CRB2如何调控H4K20me2水平？研究团队首先通过qPCR排除了其对H4K20甲基转移酶/去甲基化酶mRNA水平的影响（图5A）。随后，通过蛋白质谱分析揭示CRB2与LSD1和RAD23B互作（图5B），CRB2过表达下调LSD1（图5C）。特殊亚型LSD1(E8A)是已知的H4K20去甲基化酶。研究者证实LSD1(E8A)在多种HNSCC细胞系中表达（图5D），并发现过表达LSD1(E8A)能够特异性地逆转CRB2过表达引起的H4K20me2水平升高（图5E）。ChIP-seq显示LSD1(E8A)过表达在3,809个靶基因上降低H4K20me2。功能挽救实验证实仅LSD1(E8A)过表达抑制CRB2介导的H4K20me2上调和铁死亡（图5F-I）。表明CRB2升高H4K20me2主要通过抑制去甲基化酶LSD1(E8A)实现。

图5：CRB2通过抑制LSD1促进铁死亡并增加H4K20me2水平

 

（6） CRB2通过抑制LSD1(E8A)与USP7互作促进其降解

CRB2如何抑制LSD1(E8A)？追踪实验显示CRB2加速LSD1(E8A)降解（图6A），且该降解依赖于泛素-蛋白酶体通路（图6B）。CRB2过表达增加LSD1(E8A)泛素化水平（图6C），而敲低CRB2则降低（图6D）。IP和免疫荧光实验证实CRB2与LSD1(E8A)在细胞内直接互作且共定位（图6E-F）。

随后，研究团队探索了CRB2如何影响LSD1(E8A)稳定性。在CRB2互作蛋白中发现去泛素化酶USP7（图6G）。CRB2抑制USP7与LSD1(E8A)结合（图6H），USP7过表达逆转CRB2的铁死亡增敏效应（图6I-N）。上述研究结果表明CRB2通过抑制USP7与LSD1(E8A)互作，阻止USP7对LSD1(E8A)去泛素化稳定，从而加速LSD1(E8A)泛素化降解，最终导致H4K20me2水平升高。

图6：CRB2通过抑制USP7与LSD1互作，抑制LSD1去泛素化

 

（7） CRB2过表达与HNSCC良好预后相关

最后研究团队对20个匹配的新鲜冷冻HNSCC组织进行qRT-PCR分析，以检测CRB2 mRNA表达（图7A）。结果显示，相对于正常组织，CRB2在HNSCC中显著低表达。IHC分析表明，CRB2表达与H4K20me2正相关，与SLC7A11负相关（图7B）。Kaplan-Meier生存曲线显示，CRB2高表达的HNSCC患者总体生存期显著更长（图7C）。这些结果将前期的机制研究与临床预后紧密联系起来。

图7：CRB2过表达与HNSCC的良好预后相关

 

结论和启示

本研究通过RNA-seq、ChIP-seq及一系列功能实验，并利用临床样本验证分析揭示了CRB2通过USP7/LSD1(E8A)/H4K20me2/SLC7A11表观遗传轴促进HNSCC铁死亡的完整分子机制。CRB2通过抑制USP7与LSD1(E8A)互作，促进LSD1(E8A)泛素化降解，从而提高H4K20me2水平，表观遗传抑制SLC7A11转录，最终诱导铁死亡。CRB2过表达与HNSCC患者良好预后显著相关，提示靶向上调CRB2是一种有前景的HNSCC治疗策略。

ChIP-seq在本研究中的重要作用

全基因组H4K20me2图谱绘制：发现63.37%结合片段定位于启动子区域，为靶基因筛选提供全基因组视角。

发现SLC7A11为直接靶标：揭示H4K20me2结合片段涵盖SLC7A11位点，并通过ChIP-qPCR证实H4K20me2结合于SLC7A11启动子特定区域。

揭示LSD1(E8A)的H4K20me2调控功能：LSD1(E8A)过表达细胞的ChIP-seq显示其在3,809个靶基因上降低H4K20me2，揭示该异构体的全基因组调控功能。

排除GPX4为直接靶标：ChIP-seq和ChIP-qPCR一致显示GPX4启动子无H4K20me2富集，将研究聚焦于SLC7A11-GPX4轴的上游调控。

ChIP-seq与ChIP-qPCR证实CRB2的表观遗传功能与铁死亡表型紧密相关。

 

参考文献：

Zhang D, Hu J, Zhu G, Liu C, Li G, Lu S, Chen H, Wang X, Yu Z, Yan H, Ding Y, Zhang X, Hou J, Qiu Y, Hung MC, Lu Z, Liu Y. CRB2 Activates an Epigenetic Axis to Promote Ferroptosis in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Cancer Res. 2025 Sep 24. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-24-3866.