易基因：DNA甲基化+多组学研究案例|Cell Discov/IF12.5：黄荷凤院士团队多组学揭示复杂环境影响子代生殖健康及发育的表观遗传调控机制

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黄荷凤院士团队在《Cell Discovery》（IF12.5/Q1）期刊发表题为“Intrauterine hyperglycemia impairs mouse primordial germ cell development and fertility by sex-specific epigenetic reprogramming interference”的高水平科研成果。探究了宫内高糖环境（Intrauterine Hyperglycemia,IUHG）对子代生殖健康的影响及其表观遗传机制。

研究团队通过构建妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus,GDM)小鼠模型，结合全基因组DNA甲基化测序（WGBS）、染色质可及性测序（ATAC-seq）、转录组测序（Bulk RNA-seq和Smart-seq2）等多组学测序分析，发现IUHG对雌性和雄性子代原始生殖细胞（PGCs）的损害机制差异显著：雌性子代主要表现为染色质可及性异常，导致多能性基因调控网络无法正常闭合，从而抑制减数分裂启动，最终导致卵母细胞储备减少和生育力下降；而雄性子代则主要表现为DNA甲基化重编程受损，尤其在关键印记调控区域（ICRs），最终导致精子浓度下降和生育力降低。研究系统揭示了IUHG如何通过干扰性别特异性的表观遗传重编程，损害PGC发育、降低生育力，并产生不良代际效应。研究不仅阐明妊娠糖尿病影响子代生殖健康的复杂机制，也为未来的临床干预和预防策略提供了重要的理论基础。

英文标题：Intrauterine hyperglycemia impairs mouse primordial germ cell development and fertility by sex-specific epigenetic reprogramming interference

译文标题：宫内高糖通过性别特异性表观遗传重编程干扰影响小鼠原始生殖细胞发育和生育力

发表时间：2025年9月9日

发表期刊：Cell Discovery

影响因子：IF12.5/Q1

技术平台：WGBS、ATAC-seq、Bulk RNA-seq、Smart-seq2

作者单位：复旦大学、浙江大学、上海交通大学

 

图形摘要：正常生殖细胞发育（上）与宫内高糖环境下的发育异常（下图）

 

研究方法

（1）动物模型构建

模型：雌性ICR小鼠与野生型或Oct4-EGFP转基因雄鼠交配，妊娠第3.5天（E3.5）单次腹腔注射链脲佐菌素（120 mg/kg），诱导妊娠期高血糖，建立稳定的宫内高糖（IUHG） 模型。

对照：注射同等剂量的生理盐水。

 

（2）样本收集与细胞分选

样本收集：在胚胎发育关键时间点（E12.5、E13.5、E16.5、E17.5、E18.5）及出生后（P1、P8、12周、32周）收集雌雄子代性腺。

细胞分选：利用流式细胞术从Oct4-EGFP阳性性腺细胞中精确分选原始生殖细胞，用于后续的多组学分析。

 

（3）多组学测序与分析

Bulk RNA-seq：对E13.5雌性子代性腺进行常规转录组测序，初步探索IUHG对整体性腺转录组的影响。

Smart-seq2：对原始生殖细胞（E12.5、E13.5、E16.5）进行高灵敏度的微量转录组测序，精确分析IUHG对PGCs基因表达的精细影响。

ATAC-seq：对相同时间点的原始生殖细胞进行染色质可及性测序，揭示转录调控的“开关”状态。

WGBS：对E12.5、E13.5、E16.5的原始生殖细胞进行全基因组DNA甲基化图谱绘制，分析DNA甲基化重编程过程，揭示雄性原始生殖细胞在E16.5发生的全局性低甲基化以及印记基因调控区去甲基化。

整合分析：将RNA-seq、ATAC-seq和WGBS数据联合分析，关联基因表达、染色质开放性与DNA甲基化水平。

 

（4）验证实验

体外实验验证：分离E12.5的PGCs，在含有25 mM葡萄糖（模拟高糖环境）的培养基中培养24小时，以直接验证高糖对原始生殖细胞的直接影响。

细胞与分子生物学验证：对组织切片或染色体铺片进行免疫荧光（IF）染色，检测细胞增殖（Ki67）、凋亡（Cleaved caspase-3）、减数分裂标志物（SYCP1、SYCP3、STRA8）、性分化标志物（SALL4）、DNA修复蛋白（RPA2）以及组蛋白修饰（H3K4me3、H3K27ac）水平。代谢物检测 PGCs中α-酮戊二酸（α-KG）水平，探究代谢-表观遗传的联系。生育力测试将子代小鼠（F1）与正常小鼠交配，记录窝产仔数等指标。组织学染色通过IHC和H&E染色分析卵巢形态和卵泡数量，评估卵巢储备。

 

研究结果

（1）宫内高糖损害子代胎儿性腺发育和生育力

本研究首先证实，宫内高糖母鼠的子代无论雌雄，其生育力均显著下降，表现为窝产仔数减少。雌性子代在E17.5开始卵巢卵母细胞数量显著减少，原始卵泡储备功能下降。Bulk RNA-seq显示，E13.5宫内高糖雌性子代性腺中，上调基因显著富集于“干细胞群体维持”通路（如多能性基因Nanog、Tfap2c），而下调基因则富集于“减数分裂”通路（如Mei1、Prdm9）。这些结果表明，IUHG对雌性子代的生殖发育具有显著且特异性作用，并可能起始于PGC阶段。（图1）

 

图1：IUHG会损害雌性子代的卵母细胞发育

 

（2）宫内高糖损害子代原始生殖细胞发育，尤其影响雌性子代E13.5期减数分裂

为深入机制，研究者聚焦于原始生殖细胞（PGCs）。结果显示，在雌性子代中，IUHG组胚胎在E13.5和E16.5均出现明显发育迟缓（体重和顶臀长减小）。宫内高糖导致E13.5雌性原始生殖细胞无法正常进入减数分裂I前期，处于细线期的卵母细胞比例显著降低。同时，宫内高糖抑制了E12.5期雌雄原始生殖细胞增殖，并特异性诱导E13.5期雌性原始生殖细胞凋亡，表明减数分裂启动障碍是导致卵母细胞减少的直接原因。（图2）

图2：母体高血糖影响子代胚胎发育和生殖细胞分化

 

（3）宫内高糖导致雌性原始生殖细胞多能性退出和减数分裂启动延迟

为解析分子机制，研究团队运用Smart-seq2对分选出的PGCs（E12.5、E13.5、E16.5）进行Smart-seq2转录组测序。结果显示，宫内高糖对转录组的影响在E13.5雌性原始生殖细胞中最显著。差异表达基因分析再次验证宫内高糖导致雌性原始生殖细胞中与染色质重塑、生殖系统发育相关的多能性基因（Nanog、Sall4、Tfap2c）异常上调，而与减数分裂细胞周期、卵子发生相关的减数分裂关键基因（Stra8、Sycp1、Sycp3、Dmrtc2）显著下调。

此外，qPCR验证上述关键基因的表达变化。体外高糖培养实验进一步证实，在直接给予高糖处理后，雌性PGCs中多能性基因表达升高而减数分裂相关基因表达降低，与体内结果一致。这些结果有力地证明IUHG导致雌性PGCs延迟退出多能性状态，从而抑制减数分裂启动。（图3）

 

图3：Smart-seq2分析母体高血糖对E12.5~E16.5发育过程中胎儿原始生殖细胞的影响

 

（4）宫内高糖介导雌性原始生殖细胞的染色质可及性发生变化

研究进一步分析基因表达变化的上游调控机制。研究团队通过ATAC-seq发现，染色质可及性改变早于转录组变化。早在E12.5期，宫内高糖组原始生殖细胞就已出现显著的染色质结构差异。在E13.5雌性原始生殖细胞中，多能性基因（如Nanog、Tfap2c）的启动子区域染色质异常开放，而减数分裂相关基因的启动子区域可及性在IUHG组中降低。通过整合ATAC-seq与Smart-seq2数据，研究团队证实这种染色质的异常开放直接导致多能性基因异常高表达。此外，通过ATAC-seq数据预测，发现了可能调控此过程的关键转录因子，如调控多能性的Patz1和Tfdp1，以及调控减数分裂的Tcfl5。（图4）

图4：染色质可及性异常导致暴露于宫内高糖环境的胎儿原始生殖细胞从多能性向减数分裂的异常转变

 

（5）宫内高糖持续影响胎儿卵母细胞减数分裂进程

尽管部分雌性原始生殖细胞最终启动了减数分裂，但其进程仍受抑制。在E18.5期，宫内高糖组卵母细胞更多停滞在偶线期，难以进入粗线期和双线期，表明减数分裂的进程被持续阻滞或延迟。进一步，研究检测了同源重组过程中的DNA双链断裂（DSB）修复情况，结果显示IUHG组在粗线期的卵母细胞中，DSB修复蛋白RPA2焦点数显著增加，提示DSB修复效率低下或延迟。

RNA-seq和qPCR结果也验证在E16.5时，与维持减数分裂进程相关的基因（Mlh3、Mnd1、Rec8）表达下调、卵巢中凋亡信号增加。这些结果共同表明，IUHG对雌性生殖细胞的减数分裂过程产生持续性负调控作用，从而导致修复缺陷和发育阻滞。

图5：宫内高糖环境持续影响雌性原始生殖细胞减数分裂进程

 

（6）宫内高糖破坏雌雄子代的性别分化

有趣的是，多组学分析显示，宫内高糖处理后，E13.5期雌雄原始生殖细胞之间的转录组和染色质可及性的性别差异均减小，表明性别分化模糊。具体表现为，上调的雌性DEGs具有“雄性化”表达偏好，上调的雄性DEGs具有“雌性化”表达偏好。

RNA-seq和ATAC-seq数据综合分析显示，雌性特异性基因（如Foxl2、Rspo1、Wnt4）和雄性特异性基因（如Cbx2、Nanos2、Sox9）在相应性别的PGCs中表达降低，并且其启动子区域的染色质可及性也下降。体内和体外qPCR也验证这些性别分化关键基因的表达下调。值得注意的是，雄性PGCs中减数分裂启动基因Stra8表达上调，而雄性关键决定因子Nanos2下调，表明宫内高糖可能会延迟或干扰原始生殖细胞的正常性别分化进程。（图6）

 

图6：高糖环境下原始生殖细胞中性别特异性的转录组和染色质可及性改变

 

（7）DNA甲基化重编程在E16.5雄性原始生殖细胞中严重受损，但开放染色质重编程不显著

以往的研究表明，雄性PGCs在E16.5左右会经历全局性的DNA甲基化重编程过程，而雌性则不会。研究团队利用WGBS绘制了原始生殖细胞发育过程中的DNA甲基化动态图谱，揭示了一个显著的性别特异性现象：在对照组中，E16.5雄性PGCs的DNA甲基化水平显著上升，而雌性则保持在低水平。然而，在IUHG条件下，E16.5雄性PGCs的甲基化水平比对照组低约10%，表明其DNA甲基化重编程过程严重受损。但这种低甲基化在雌性PGCs中并未观察到。研究进一步分析了印记调控区域（ICRs）的甲基化水平，WGBS热图和甲基化轨迹显示，IUHG组E16.5雄性PGCs中，H19、Gpr1/Zdbf2、Dlk1-Gtl2等多个关键ICR位点甲基化水平显著降低。这些ICR甲基化变化与其下游印记基因表达变化一致。相比之下，雌性原始生殖细胞的DNA甲基化水平未受显著影响。

上述研究结果表明，IUHG通过干扰其E16.5时期关键的DNA甲基化重编程进而破坏雄性PGCs，特别是ICRs的甲基化建立，可能导致精子发生障碍和代际效应。

 

图7：暴露于宫内高糖环境的E16.5雄性原始生殖细胞发生全基因组DNA低甲基化

 

结论和启示

本研究通过表观遗传多组学分析（Bulk RNA-seq、Smart-seq2、ATAC-seq、WGBS）系统阐明了孕期宫内高糖环境如何通过破坏原始生殖细胞（PGCs）性别特异性的表观遗传重编程，导致子代生殖发育异常和生育力下降：

对雌性子代主要通过导致染色质可及性异常，使原始生殖细胞无法闭合多能性基因功能，从而抑制减数分裂启动，降低卵巢卵泡储备和生育力。

对雄性子代主要通过破坏原始生殖细胞的DNA甲基化重编程，特别是印记基因调控区的甲基化建立，导致精子发生异常和生育力下降，并可能产生代际遗传效应。

研究展示了多组学在解析复杂环境因素对生殖细胞发育影响的重要作用，完整回答了“IUHG在哪里、如何、以及通过什么表观遗传机制造成了子代生殖发育异常和生育力下降损害”这一核心科学问题。

 

参考文献：

Cong J, Li Q, Li Y, Li M, Shi Y, Hu P, Yin X, Zhang Q, Sheng J, Li J, Ding G, Zhang Y, Huang H. Intrauterine hyperglycemia impairs mouse primordial germ cell development and fertility by sex-specific epigenetic reprogramming interference. Cell Discov. 2025 Sep 9;11(1):74. doi: 10.1038/s41421-025-00821-0.