易基因：JITC/IF10.6：多组学分析揭示肿瘤免疫治疗预测和监测的血浆cfDNA甲基化标志物|前瞻性转化研究

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晚期胃癌（aGC）对联合免疫治疗应答存在显著异质性。循环细胞游离DNA（cfDNA）可实现肿瘤动态的非侵入性分析，并可能为监测治疗效果提供生物标志物。2026年4月15日，南京医科大学靳光付/颜财旺团队在《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》（IF 10.6/Q1）期刊发表题为“Comprehensive molecular characterization of cfDNA as predictive and monitoring biomarkers in advanced gastric cancer receiving immunotherapy”的前瞻性转化医学研究成果，探索了cfDNA作为晚期胃癌患者接受联合免疫治疗的预测与监测生物标志物潜力。

研究纳入94例接受PD-1抑制剂联合铂类化疗（±抗血管生成类药物）治疗的晚期胃癌（aGC）患者，分为发现集（n=49）和验证集（n=45）。发现集采用低深度全基因组测序（LP-cfWGS）和全基因组亚硫酸盐测序（cfWGBS）对治疗前及治疗后的血浆cfDNA进行多组学分析；验证集采用靶向亚硫酸盐测序（cfDNA-TBS）对候选差异甲基化区域（DMRs）进行验证。研究发现，免疫治疗应答个体在治疗后表现出更长的cfDNA片段、更低的肿瘤分数（TF）、更低的染色体不稳定性（CIN）以及更高的整体甲基化水平。研究构建基于cfDNA甲基化的预测和监测模型作为疗效监测标志物，克服现有PD-L1 CPS、TMB和MSI-H等生物标志物局限性。

 

英文标题：Comprehensive molecular characterization of cfDNA as predictive and monitoring biomarkers in advanced gastric cancer receiving immunotherapy

译文标题：晚期胃癌免疫治疗中cfDNA作为预测及监测生物标志物的综合分子特征分析

发表时间：2026年4月15日

发表期刊：Journal for Immuno Therapy of Cancer

影响因子：IF10.6/Q1

技术平台：LP-cfWGS、cfWGBS、cfDNA-TBS

作者单位：南京医科大学、东南大学等

DOI:10.1136/jitc-2025-013792

 

易小结

本研究通过整合cfDNA多分子表征（片段长度、拷贝数变异和甲基化谱），建立全面、多维度的液体活检生物标志物于预测和监测晚期胃癌患者的免疫治疗效果，推动液体活检在肿瘤精准免疫治疗中的应用。

免疫治疗时代，cfDNA甲基化以其组织特异性、早期发生性、体液中高度稳定性和非侵入性，成为连接肿瘤生物学行为与全身免疫应答的关键标志物。

 

 

研究方法

 

（1）研究设计与患者入组

 

纳入94例晚期胃癌患者进行前瞻性生物标志物研究，分为发现集（49例）和内部验证集（45例）。

 

所有患者均接受联合免疫治疗（PD-1抑制剂如纳武利尤单抗、替雷利珠单抗或卡瑞利珠单抗，联合铂类化疗，部分联合抗血管生成类药物）。

 

（2）cfDNA样本采集与测序

 

采集患者治疗前（7天内）和两个治疗周期后（第三周期开始前7天内）的外周静脉血，每次8mL。分离血浆、提取cfDNA。

 

发现集

 

LP-cfWGS：分析片段长度分布、拷贝数变异（CNAs）、染色体不稳定性指数（GII）和肿瘤分数（TF）。

 

cfWGBS：在单碱基分辨率下全面分析cfDNA全基因组甲基化图谱，鉴定差异甲基化区域（DMR）。

 

验证集

 

cfDNA-TBS：基于发现集结果设计探针捕获候选DMRs进行高深度靶向甲基化测序，以验证预测和监测模型。

 

（3）临床结局评估

 

肿瘤应答：每6周CT评估

 

最佳总体应答（BOR）：CR（完全缓解，所有靶病灶完全消失）或PR（部分缓解，靶病灶直径总和较基线减少≥30%），或SD（疾病稳定，PFS≥6个月）定义为应答者；SD（PFS＜6个月）或PD（疾病进展，靶病灶直径总和较研究中最小总和增加≥20%或出现新病灶）定义为非应答者

 

无进展生存期（PFS）：治疗开始至疾病进展或死亡的时间

 

总生存期（OS）：治疗开始至任何原因死亡的时间

 

客观缓解率（ORR）：95%CI 

 

图1：研究设计

 

结果图形

（1）患者特征与治疗应答

本研究共纳入94例接受联合免疫治疗的晚期胃癌患者，其中发现集49例，验证集45例。根据RECIST V.1.1标准评估的最佳总体应答（BOR）。在发现集中，完全缓解（CR）0例，部分缓解（PR）29例，疾病稳定（SD）16例，疾病进展（PD）4例，客观缓解率（ORR）为59.2%。在验证集中，PR 23例，SD 16例，PD 6例，ORR为51.1%。根据研究定义，发现集中有34例应答者和15例非应答者，验证集中有30例应答者和15例非应答者。重要的是，两组患者在年龄、性别、Lauren分型、原发肿瘤部位等临床病理特征上均无显著差异，且潜在的免疫治疗预测因子PD-L1状态和微卫星不稳定性（MSI）状态在两组间也表现出可比性。这一基线均衡性为后续cfDNA分子特征的差异分析提供了可靠的基础，表明所发现的cfDNA差异确实可能与治疗效果相关，而非混杂临床病理因素所致。

 

（2）按治疗应答分层的晚期胃癌患者cfDNA基因组图谱分析

研究者首先分析了cfDNA的基本特征，发现治疗前后cfDNA浓度在应答者和非应答者之间无显著差异，且与肿瘤大小无显著相关性。这一发现排除cfDNA总量作为预测标志物的可能性，提示需要深入其分子特征而非单纯浓度分析。

在基因组特征方面，治疗前两组cfDNA片段长度分布无差异；但治疗后，应答者的cfDNA片段长度显著变长（中位片段大小：166.85 vs 168.49bp, p=0.016）（图2A），同时短片段（20-150bp）比例和短/长片段比（100-150bp/151-220bp）均显著下降。这表明应答者在有效治疗后，肿瘤来源的短片段DNA减少，血浆中正常细胞的较长片段DNA相对富集，反映治疗有效的患者肿瘤负荷下降。

接着，研究者分析拷贝数变异（CNAs）以评估cfDNA肿瘤分数（TF）和染色体不稳定性指数（GII）。结果显示，治疗前两组GII和TF无显著差异，但治疗后应答者的GII（中位数：0.026 vs 0.007）（图2C）和TF（中位数：0.057 vs 0.010）（图2D）均显著下降，而非应答者基本保持基线CNA特征，说明有效治疗后染色体不稳定性恢复，肿瘤来源DNA大幅减少。研究人员通过两个代表性病例（图2E-H）（应答者EP05和非应答者EP24）的CT影像与基因组图谱对比，直观地展示了影像学缓解与cfDNA肿瘤分数下降的对应关系，以及疾病进展与cfDNA肿瘤分数上升的相关性，验证了cfDNA信号在反映肿瘤动态变化中的准确性。

图2：免疫治疗前后cfDNA动态变化分析

 

（3）cfDNA甲基化组学分析揭示晚期胃癌患者与治疗应答相关特征

基于发现集的cfWGBS数据，研究者在治疗前血浆cfDNA中鉴定出325个差异甲基化区域（DMRs），其中64.3%在应答者中呈现高甲基化，35.7%呈现低甲基化，这些DMRs比对到172个与抗肿瘤免疫和和免疫检查点阻断应答相关基因（如TNFSF9、HLA-DPA1、LTA）。功能富集分析显示这些DMR相关基因在单核细胞增殖、淋巴细胞增殖、T细胞增值等免疫相关通路中显著富集（图3A）。

通过随机森林（RFE）和LASSO回归的机器学习两步筛选，最终从325个DMRs中筛选出17个候选DMRs，并在验证集中通过靶向亚硫酸盐测序（cfDNA-TBS）进行验证。其中，位于chr20:25849353-25849490的DMR在发现集（图3B）和验证集（图3C）中均稳定地表现出在应答者中甲基化水平显著升高趋势。为排除MSI-H状态的潜在混杂，限制性分析（仅MSS个体）确认该DMR在应答者和非应答者间仍存在差异。

在预测性能评估中，DMR单独模型的预测性能（AUC=0.79）优于传统的PD-L1 CPS单独模型（AUC=0.65），而将两个模型联合后，性能进一步提高（AUC=0.81）（图3D）。在验证集中也观察到类似趋势（DMR单独AUC=0.72，联合AUC=0.75）（图3E）。更关键的是，高甲基化的chr20 DMR与更长的无进展生存期（中位数5.93vs12.83月）（图3F）和总生存期（中位数13.5月vs未达到）（图3G）显著相关。上述研究结果表明cfDNA甲基化测技术在免疫治疗预测中优于传统标志物的潜力，通过全基因组发现和靶向精准验证，定位到高效、稳定的甲基化预测标志物。

图3：晚期胃癌免疫治疗应答预测的基线cfDNA甲基化差异分析

A. 晚期胃癌患者治疗前血浆cfWGBS数据的无监督聚类分析（发现集：34例应答者（R-pre），15例非应答者（NR-pre））。热图展示DMRs甲基化水平。

B–C. 发现集（B）和验证集（C）中DMR chr20:25849353-25849490的甲基化水平。

D–E. 发现集（D）和验证集（E）中预测效能评估的ROC曲线。比较的模型包括：PD-L1 CPS（联合阳性评分）、DMR chr20:25849353-25849490、PD-L1 CPS+DMR联合模型。

F–G. 按DMR chr20甲基化水平（高 vs 低）分层的Kaplan-Meier生存分析，虚线表示中位生存期。

 

（4）晚期胃癌在免疫治疗过程中的cfDNA甲基化变化

为探索cfDNA甲基化在治疗过程中的动态监测价值，研究者比较了发现集中治疗前后的cfDNA甲基化谱，鉴定出5199个与治疗相关的DMRs，其中96.3%在治疗后甲基化水平升高（图4A）。这些DMRs注释到995个基因，主要富集在免疫应答调控信号通路和B细胞受体信号通路。

再次通过机器学习筛选，鉴定出3个具有免疫治疗监测潜力的DMRs（chr8:110479193-110480324，chr8:118268691-118269430，chr8:50891437-50892120）。分析发现，这三个DMRs在应答者治疗后均表现出显著的甲基化水平升高（图4B-D），而非应答者无此趋势，且这种差异趋势不受MSI状态影响。

进一步生存分析表明，chr8:110479193-110480324（中位数4.90vs11.57个月）（图4E）和chr8:50891437-50892120（中位数5.20vs10.20个月）（图4F）这两个DMRs的甲基化水平升高与显著改善的PFS相关，但OS无显著差异。

上述研究发现将cfDNA甲基化测序应用从单一的“预测”扩展到“动态监测”领域。通过追踪治疗过程中特定甲基化位点变化，可以实时评估治疗的分子应答，为临床医生早期判断疗效、及时调整治疗方案提供了全新的、无创的监测工具。

图4：免疫治疗晚期胃癌中cfDNA甲基化动态变化及其与生存期相关性

A. 接受联合免疫治疗的晚期胃癌患者治疗前（pre）和治疗后（post）血浆cfDNA甲基化谱的无监督聚类（发现集：34例应答者（R-pre/R-post），15例非应答者（NR-pre/NR-post））。热图展示cfWGBS的DMRs。

B–D. 比较3个8号染色体DMRs在不同治疗阶段甲基化水平的箱线图。非配对样本模型纳入年龄、性别、肿瘤分数、肿瘤大小和DMR甲基化水平；配对样本模型纳入肿瘤大小和DMR甲基化水平。

E–F. 按DMR甲基化水平降低与升高分层的患者无进展生存期（PFS）生存曲线分析。给定DMR治疗后甲基化水平低于基线时，分入降低组；治疗后水平高于基线时，分入升高组。水平虚线表示中位生存期。

 

结论和启示

本研究通过整合LP-cfWGS、cfWGBS和验证集中的cfDNA-TBS综合分析，鉴定出晚期胃癌免疫治疗应答患者的特异性cfDNA特征，包括短片段减少、CIN减弱、TF降低和整体甲基化水平升高。基于甲基化的预测模型是识别可能从免疫治疗中获益患者的临床可及工具。

cfDNA甲基化测序因其独特的稳定性、组织特异性和对早期变化的敏感性，不仅可用于筛选最可能从免疫治疗中获益的患者，更有可能发展为贯穿整个治疗周期的“智能监测工具”，指导适应性治疗、预测复发和耐药。本研究为将甲基化液体活检从实验室推向临床应用提供了强有力的证据和典型示例。

 

参考文献：Fang J, Yu Y, Sun Y, Ji M, Jiang Y, Chen X, Yan C, Jin G. Comprehensive molecular characterization of cfDNA as predictive and monitoring biomarkers in advanced gastric cancer receiving immunotherapy. J Immunother Cancer. 2026 Apr 15;14(4) doi: 10.1136/jitc-2025-013792.