易基因：项目文章|APSB/14.6：梁云生教授团队DNA羟甲基胞嘧啶(5hmC)多组学研究揭示提升黑色素瘤免疫治疗效果新机制

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近日，南方医科大学皮肤病医院王迪博士后等为第一作者、中南大学湘雅二医院皮肤科/南方医科大学皮肤病医院梁云生教授等为通讯作者，在国际权威药学学术期刊《Acta Pharmaceutica Sinica B》（APSB）（14.6/Q1）发表题为“Loss of TET2 sulfhydration results in destabilization of TET2 and down-regulation of the immune response in melanoma”的研究论文，系统揭示了TET2蛋白硫巯基化（S-sulfhydration）修饰在黑色素瘤中的关键调控作用。易基因科技为本研究提供5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）（RRBS+oxRRBS）测序分析技术服务，助力从表观遗传学角度揭示增强黑色素瘤免疫治疗疗效的新通路。

研究发现，黑色素瘤中TET2蛋白硫巯基化水平显著降低，且与临床分期呈负相关；通过质谱鉴定出C1186/C1202双位点为关键硫巯基化位点，维持TET2蛋白稳定性、锌指结构完整性及DNA羟甲基化催化活性至关重要。活性硫物质（如硫代硫酸钠STS和硫化氢供体NaHS）能够恢复TET2硫巯基化修饰，上调TET2蛋白表达，重编程全基因组DNA羟甲基化（5-hmC）图谱，并通过增强IFN-γ/STAT1信号通路促进Th1型趋化因子（Cxcl9、Cxcl10、Cxcl11）和MHC-I分子表达，从而增强CD8+ T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。并与抗PD-1免疫检查点抑制剂联合使用表现出显著协同效应，为克服黑色素瘤免疫治疗耐药提供新策略。

 

英文标题：Loss of TET2 sulfhydration results in destabilization of TET2 and down-regulation of the immune response in melanoma

译文标题：TET2硫巯基化修饰缺失介导黑色素瘤TET2蛋白失稳和免疫应答下调

发表时间：2026年4月19日

发表期刊：Acta Pharmaceutica Sinica B

影响因子：IF14.6/Q1

技术平台：RRBS+oxRRBS、RNA-seq等

作者单位：南方医科大学皮肤病医院、中南大学湘雅二医院、中山大学附属第三医院等

DOI：10.1016/j.apsb.2026.04.010

 

TET2蛋白缺失导致DNA 5-羟甲基化（5-hmC）水平降低是黑色素瘤中的一种关键表观遗传改变，然而调控TET2稳定性机制尚未阐明。本研究在临床黑色素瘤样本中分析了TET2的硫巯基化修饰，首先通过质谱技术鉴定出其硫巯基化修饰位点，并在黑色素瘤细胞中评估活性硫对TET2稳定性、催化活性及全基因组5-hmC水平的作用。研究结果显示，黑色素瘤中TET2硫巯基化显著缺失，并在晚期阶段进一步降低。研究鉴定出C1186/1202位点所在的半胱氨酸富集锌指结构域是关键硫巯基化区域，该修饰对于维持TET2的稳定性和酶活性至关重要。活性硫能够恢复TET2硫巯基化修饰，上调TET2蛋白水平，并重编程全基因组DNA羟甲基化图谱。值得注意的是，活性硫通过增强黑色素瘤细胞中IFN-γ诱导的Th1型趋化因子和MHC-I表达，与抗PD-1治疗产生协同作用，从而增强CD8+ T细胞介导的免疫应答。本研究结果表明，C1186/1202位点硫巯基化是维持TET2稳定性与功能的关键翻译后修饰，在表观遗传调控和抗肿瘤免疫中发挥重要作用，并揭示活性硫物质作为免疫佐剂在黑色素瘤免疫治疗中的潜力。

图形摘要

 

易小结

本研究揭示了黑色素瘤免疫逃逸和TET2功能失调的核心机制：硫巯基化作为一种动态可逆修饰将细胞代谢（活性硫）、表观遗传（DNA羟甲基化）和肿瘤免疫三者紧密联系起来，为理解肿瘤微环境中复杂调控网络提供新思路。

RRBS+oxRRBS表观基因组学技术帮助研究者从DNA羟甲基化动态变化中快速锁定关键的效应基因和通路，促进从“分子修饰”到“整体效应”深度机制研究，进一步推动精准表观遗传学和免疫治疗研究发展。

 

 

研究方法

 

（1）样本材料

 

临床样本：收集不同临床分期黑色素瘤患者（n=25）及黑色素痣（nevus，n=5）的组织样本。

 

细胞样本：人表皮黑素细胞、B16-OVA（小鼠黑色素瘤）和A375（人黑色素瘤）细胞系。

 

（2）分子与蛋白分析

 

蛋白质修饰鉴定：马来酰亚胺法特异性检测TET2蛋白的硫巯基化水平，LC-MS/MS质谱检测鉴定TET2蛋白上具体的硫巯基化修饰位点。

 

位点功能验证：构建TET2敲除细胞系，并利用定点突变技术（如C1186A, C1202A）验证关键位点的功能。

 

蛋白质互作与稳定性分析：免疫共沉淀（Co-IP）、染色质免疫沉淀（ChIP-qPCR）、环己酰亚胺（CHX）追踪蛋白半衰期等方法，研究TET2与STAT1的互作、DNA结合能力及降解通路。

 

锌离子结合测定： 使用PAR螯合法检测TET2蛋白的锌离子结合能力。

 

（3）分子机制探索和验证

 

Dot blot：检测基因组DNA整体5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）水平。

 

DNA羟甲基化测序（RRBS+oxRRBS）：对B16-OVA黑色素瘤细胞在对照、STS、IFN-γ及联合处理下的基因组DNA进行全基因组5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）分析，揭示全基因组5hmC重编程过程，从而将TET2硫巯基化修饰与其下游表观遗传学功能直接关联。

 

转录组测序（RNA-seq）：分析不同处理后细胞的转录组变化，鉴定差异表达基因。并与RRBS/oxRRBS数据进行整合分析，关联羟甲基化变化与基因表达变化。

 

（4）动物模型与体内实验

 

模型构建：建立小鼠B16-OVA黑色素瘤移植瘤模型，评估STS单药、抗PD-1单药及联合治疗疗效。

 

药物干预：腹腔注射STS、抗PD-1抗体或两者联用，评估对肿瘤生长的协同抑制效应。

 

免疫细胞分析：流式细胞术、免疫荧光等分析肿瘤微环境中免疫细胞（尤其是CD8+ T细胞）数量、表型和功能。

 

 

结果图形

 

（1）黑色素瘤中TET2蛋白硫巯基化修饰缺失与临床分期相关

 

研究首先验证了TET家族在黑色素瘤中的临床相关性。通过对临床样本的分析发现，与良性痣相比，黑色素瘤组织中TET2的蛋白水平显著降低，且随着肿瘤病理分期（I-IV期）进展呈梯度下降，这与患者总生存期缩短相关。更重要的是，研究还发现TET2蛋白硫巯基化修饰水平在黑色素瘤中同样显著降低，且这种降低与肿瘤分期呈显著负相关，也与TET2催化产物（整体DNA 5-hmC水平）呈正相关。表明TET2硫巯基化丢失不仅是黑色素瘤的表观遗传特征，更是驱动其恶性进展的重要因子（图1）。

 

 

图1：TET2硫巯基化修饰缺失与黑色素瘤临床分期相关

 

 

（2）TET2硫巯基化修饰增强其蛋白稳定性和催化活性

 

为探究TET2硫巯基化缺失的作用，作者在细胞模型中进行功能研究。研究人员发现黑色素瘤细胞中的硫烷硫（sulfane sulfur，硫巯基化底物）水平显著低于正常黑色素细胞，而补充活性硫物质（STS或NaHS）可以恢复TET2硫巯基化水平和蛋白表达，但不影响其mRNA水平，同时提升整体5-hmC水平。提示这是一个转录后调控机制。具体而言，活性硫通过硫巯基化显著延缓TET2蛋白降解速度，而使用硫巯基化抑制剂Diamide则抵消这一保护作用。进一步研究发现，钙蛋白酶（calpain）系统是介导TET2降解的主要通路。体内实验证实，STS的抗肿瘤效果完全依赖于TET2的存在及其硫巯基化修饰。上述研究表明，硫巯基化修饰是调控TET2蛋白稳定性与功能的关键修饰（图2）。

图2：TET2硫巯基化修饰增强其蛋白稳定性和催化活性

 

（3）活性硫通过硫巯基化C1186和C1202双位点以稳定TET2蛋白表达

为精确定位TET2上的功能硫巯基化位点，研究者进行LC-MS/MS质谱分析，鉴定出TET2蛋白锌指结构域中的C1186和C1202是两个关键的硫巯基化位点。结构分析表明，C1186和C1202对于维持锌指结构的完整性至关重要。STS诱导的硫巯基化增强TET2与锌离子的结合能力，从而稳定了其空间构象。当这两个关键位点突变后，TET2无法抵抗钙蛋白酶介导的降解，而抑制钙蛋白酶则可恢复其蛋白水平。这揭示了硫巯基化通过稳定锌指结构来防止TET2被异常降解的精确分子机制（图3）。

图3：活性硫通过C1186和C1202双位点硫巯基化稳定TET2蛋白表达

 

 

（4）活性硫在体内与抗PD-1治疗具有协同效应

 

基于TET2在肿瘤免疫中的已知作用，研究探索了STS与抗PD-1联合治疗的潜力。在B16-OVA黑色素瘤小鼠模型中，STS单药或抗PD-1单药均能一定程度抑制肿瘤生长，但两者联合治疗产生显著的协同效应，肿瘤抑制效果最强。这一协同效应在接种TET2 C1186/C1202A突变肿瘤细胞的小鼠中完全消失，表明其严格依赖于TET2的硫巯基化修饰。

 

具体而言，联合治疗显著增加肿瘤组织内CD8+ T细胞浸润，并系统性提升血液和淋巴结中的CD8+ T细胞数量，此效应同样依赖TET2功能位点。分子层面，联合治疗显著上调肿瘤内Th1型趋化因子（Cxcl9, Cxcl10, Cxcl11）的mRNA水平以及肿瘤细胞表面的MHC-I表达。进一步ChIP-qPCR实验揭示，STS处理促进TET2在IrF1基因启动子区富集，而IRF1是MHC-I表达的关键转录因子。上述研究结果表明，STS通过诱导TET2硫巯基化，表观遗传地上调IRF1转录，进而增强肿瘤细胞的MHC-I抗原呈递功能，并促进肿瘤内Th1型趋化因子产生，从而协同增强抗PD-1治疗效果（图4）。

图4：活性硫在体内与抗PD-1治疗具有协同效应

 

 

（5）活性硫通过增强CD8+ T细胞活性并抑制其耗竭以提升PD-1抑制的抗肿瘤活性

 

研究进一步揭示联合治疗增强抗肿瘤免疫的的细胞机制。流式细胞术分析显示，与单药治疗相比，STS与抗PD-1联合治疗能显著增加肿瘤微环境、血液、脾脏和淋巴结中产生IFN-γ和TNF-α的CD8+ T细胞比例，表明CD8+ T细胞的效应功能被强激活。同时，联合治疗还显著降低终末缺失CD8+ T细胞（PD-1+Lag-3+）在肿瘤中的比例。

 

重要的是，这些免疫增强效应在携带TET2 C1186/C1202A突变肿瘤的小鼠中大部分被抑制，证明TET2硫巯基化的核心作用。最后，通过使用CD8中和抗体特异性清除小鼠体内的CD8+ T细胞，联合治疗的抗肿瘤效果被完全消除，确证其治疗效果完全依赖于CD8+ T细胞。总结而言，STS通过TET2硫巯基化，不仅促进了CD8+ T细胞活性，还逆转其缺失状态，从而最大化PD-1抗肿瘤治疗效果（图5）。

图5：活性硫通过增强CD8+ T细胞活性并抑制其缺失以提升PD-1抑制的抗肿瘤效果

 

 

（6）活性硫重编程IFN-γ诱导的全基因组DNA羟甲基化并激活黑色素瘤中的关键免疫信号通路

 

为从全基因组DNA修饰层面阐明STS如何通过TET2调控免疫基因网络，研究团队利用RRBS+oxRRBS技术比较对照组、IFN-γ处理组、STS+IFN-γ联合处理组的黑色素瘤细胞的全基因组范围5-hmC分布。分析结果显示，联合处理组表现出特异性全基因组5-羟甲基胞嘧啶重编程模式。与IFN-γ单药组相比，联合处理组整体5-羟甲基胞嘧啶水平显著升高。更重要的是，联合处理组中发生5-羟甲基胞嘧啶水平“获得”的基因主要富集在JAK-STAT信号、I型干扰素等免疫相关通路；而发生5-羟甲基胞嘧啶水平“丢失”的基因则主要富集在Notch、Wnt、p53等致癌通路。

 

随后，研究者将RRBS+oxRRBS数据与RNA-seq数据进行综合分析。结果显示，1594个基因表达受DNA羟甲基化水平变化调控。联合处理组中表达上调的基因包括趋化因子（Cxcl9/10/11）、转录因子Stat1以及MHC-II相关基因（H2-Ab1等）。通过5hmC-ChIP-qPCR进一步验证，发现联合处理可以显著增强Ifngr2、Stat1、Irf1等关键免疫基因上的5-羟甲基胞嘧啶富集，同时降低黑色素瘤Nras、Akt1、Mtor致癌基因上的5-羟甲基胞嘧啶水平。上述研究结果表明STS通过修复TET2功能，在基因组层面实现精准表观遗传重编程（图6）。

 

图6：活性硫重编程全基因组DNA 5-hmC水平并激活黑色素瘤中的关键免疫信号通路

 

（7）TET2硫巯基化促进其被STAT1招募以增加IFN-γ诱导的Th1型趋化因子产生

最后，研究团队揭示了TET2调控下游免疫基因表达的精确分子机制。研究者发现，STS单独处理对Cxcl9/10的表达影响较小，但能显著协同增强IFN-γ诱导的Cxcl9/10表达。这一协同效应在TET2敲除或表达C1186/C1202A突变的细胞中被完全抑制，表明其依赖于TET2及其硫巯基化修饰。

已知IFN-γ主要通过JAK-STAT通路发挥作用，且STAT1可以招募TET2。因此，作者通过免疫共沉淀实验发现，IFN-γ与STS联合处理能极大地促进TET2与STAT1的物理结合，而这一结合在TET2突变或使用Diamide处理后显著减弱。ChIP-qPCR实验进一步显示，联合处理显著增强TET2在Cxcl9和Cxcl10启动子区招募，并导致这些区域5hmC水平的爆发性增长，这些效应均依赖于TET2硫巯基化位点。

上述研究揭示了一条从STS介导TET2硫巯基化、TET2蛋白稳定、TET2被STAT1招募至IFN-γ应答基因（Cxcl9/10）启动子、促进DNA羟甲基化、激活基因转录、产生Th1型趋化因子、招募CD8+ T细胞活性的完整分子通路，为活性硫如何连接肿瘤细胞内表观遗传状态与细胞外免疫细胞招募提供了直接证据（图7）。

图7：TET2的硫巯基化促进其被STAT1招募，从而增加IFN-γ诱导的Th1型趋化因子产生

 

 

结论和启示

 

本研究利用RRBS+oxRRBS+RNA-seq等分析揭示了TET2在C1186/C1202位点的硫巯基化修饰是其维持稳定性和功能的关键，该修饰在黑色素瘤中缺失导致免疫应答下调。活性硫物质可通过修复此修饰，协同提升PD-1抑制剂治疗疗效，表明靶向表观遗传酶的翻译后修饰是一种极具潜力的肿瘤免疫治疗新策略。

 

RRBS+oxRRBS在本研究中的重要作用

 

绘制了在活性硫联合IFN-γ刺激下黑色素瘤细胞基因组的精细5-羟甲基胞嘧啶图谱，发现了受STS/TET2调控的免疫相关通路；并揭示在IFN-γ刺激和STS干预下，羟甲基化图谱的动态重编程过程；进而将TET2硫巯基化修饰与其下游的整体表观遗传重塑和免疫基因激活联系起来。

 

 

参考文献：Wang D, Deng W, Xie Y, Xie A, Chang Y, Li S, Chen Y, Gao L, Zhang Y,Yu Z, Wang B, Xu Y, Wu H, Ding Y, Yang B, Zhang L, Liang Y, Loss of TET2 sulfhydration results in destabilization of TET2 and down-regulation of the immune response in melanoma, Acta Pharmaceutica Sinica B, https://doi.org/10.1016/j.apsb.2026.04.010.