Cell Rep Med/IF10.6：北京天坛医院团队WGBS等揭示高危型儿童肿瘤的DNA甲基化标记物和潜在治疗靶点

 

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2025年12月16日，首都医科大学附属北京天坛医院联合中科院大学、华大研究院和北京化工大学等多个团队，在双1区TOP期刊《Cell Reports Medicine》发表题为“Targeting TET3 suppresses group 3 medulloblastoma stemness and progression via impairing hypomethylation of Otx2 super-enhancer”的科研成果。研究聚焦3型髓母细胞瘤（Group 3 Medulloblastoma, G3-MB）这一预后差、肿瘤干性强、转移率高的儿童恶性脑肿瘤亚型，发现超级增强子（Super-Enhancer, SE）低甲基化是维持 G3-MB干性和肿瘤进展的关键表观遗传机制，而Otx2超级增强子低甲基化是G3-MB患者的预后标记物和潜在治疗靶点。

研究团队利用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）技术绘制了189例未经治疗MB样本的单碱基分辨率DNA甲基化图谱，并综合单细胞转录组（snRNA-seq）和染色质可及性（snATAC-seq）数据，系统揭示了G3-MB中SE低甲基化的表观遗传表征。研究发现，Otx2基因超级增强子低甲基化是维持肿瘤干性和驱动恶性进展的核心机制。转录因子OTX2通过招募DNA去甲基化酶TET3，特异性介导Otx2 SE区域DNA去甲基化，形成OTX2-TET3正反馈自调控环路，从而维持OTX2高表达和肿瘤干性。基于上述结果，研究开发了脂质纳米颗粒（LNP）递送系统，通过TET3抑制剂（Bobcat339）或siRNA，在患者来源的异种移植瘤模型中显著抑制肿瘤生长，为G3-MB这一高危亚型提供了新的预后标记物和靶向治疗策略。

 

 

英文标题：Targeting TET3 suppresses group 3 medulloblastoma stemness and progression via impairing hypomethylation of Otx2 super-enhancer

译文标题：靶向TET3通过破坏Otx2超级增强子低甲基化抑制3型髓母细胞瘤干性和进展

发表时间：2025年12月16日

发表期刊：Cell Reports Medicine

影响因子：IF10.6/Q1

技术平台：WGBS等

作者单位：北京天坛医院、中科院大学、华大研究院、北京化工大学、北京儿童医院、广州中医药大学等

DOI:10.1016/j.xcrm.2025.102474

 

易小结

本研究从表观遗传调控的崭新视角，不仅揭示了“增强子低甲基化-染色质开放-癌基因激活”这一核心通路，更将基础发现转化为治疗潜力，标志儿童脑肿瘤研究从分子分型走向机制驱动的精准治疗。

WGBS技术在本研究中单碱基分辨率绘制了DNA甲基化图谱，精准捕获增强子等远端调控元件的甲基化变化。未来WGBS结合多组学分析，有望在更多复杂疾病中揭示新的表观遗传驱动因子和治疗靶点。

 

 

研究方法

 

1、队列与样本

 

•  发现队列：80例未经治疗的MB样本，经病理确诊、知情同意及伦理审批
•  验证队列：109例独立MB样本，用于DMR分子分型稳定性验证
•  已发表数据：GEO数据库（DNA甲基化芯片及RNA-seq，567例）、EGA数据库（正常小脑WGBS）

 

2、多组学测序分析

 

• 全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）：对样本进行高深度（平均~16.38X）测序，获得全基因组单碱基分辨率的DNA甲基化图谱，并进行分子分型与差异甲基化区域（DMR）分析。
•  Bulk RNA测序（RNA-seq）：对169个样本进行转录组分析，关联甲基化与基因表达。
• 单核RNA测序（snRNA-seq）与单核ATAC测序（snATAC-seq）：分别对9个和8个G3-MB样本进行，解析肿瘤细胞异质性、细胞状态及染色质可及性。

 

3、分子机制验证实验

 

• 机制验证：染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、CUT&Tag-seq（TET3）、染色质构象捕获（Hi-C）、报告基因实验、免疫共沉淀（Co-IP）、定量甲基化特异性PCR（qMSP）等，验证OTX2与TET3的互作、结合及对Otx2 SE的调控。
• 功能验证：在D283、D458等G3-MB细胞系中进行基因敲低/过表达、细胞增殖、侵袭、分化（检测Ki-67, NeuN等标记物）实验。

 

4、临床前治疗验证

 

• 纳米药物开发：构建负载TET3抑制剂Bobcat339或siTET3的脂质纳米颗粒（LNP）。
• 体内模型：建立基于细胞系（D283）和患者来源肿瘤组织（PDX）的小鼠/大鼠原位移植瘤模型。
• 疗效评估：通过脑部显微MRI监测肿瘤体积，进行生存分析，并通过组织学染色评估增殖、分化和侵袭标记物变化。

 

图形摘要

 

结果图形

（1）整合表观基因组和转录组分析重现髓母细胞瘤分子亚型

本研究首先建立了基于WGBS的MB分子分型体系。研究发现基于发现队列80例样本的全基因组DNA甲基化图谱可以准确地将MB分型为WNT-MB、SHH-MB、G3-MB和G4-MB四个亚型（图1A）；验证队列109例样本基于相同DMR集合同样实现稳定聚类（图1B）。上述研究结果表明DNA甲基化是MB亚型的稳定标记物，并初步揭示DNA甲基化在塑造MB亚型特异性转录程序中的基础作用。

 

 图1：功能性超级增强子差异甲基化区域（F-seDMR）靶向基因与小脑早期发育特征相关

 

（2）超级增强子DNA低甲基化与髓母细胞瘤发生相关

研究团队系统解析了DMR在基因组元件中的分布特征。在四个亚型中，超级增强子（SE）区域均富集DMR，提示SE的表观遗传失调是MB的共同特征（图1C）。通过配对样本的甲基化和基因表达关联分析，发现se区域的DMR（seDMRs）靶向基因与甲基化水平呈现最显著负相关性，显著强于启动子DMR（pDMR）和基因体DMR（bDMR）（图1D），尤其在G3-MB中的负调控最为显著。研究团队将甲基化与表达显著负相关的seDMR定义为“功能seDMR”（F-seDMR）。值得注意的是，低甲基化F-seDMR（hypo-F-seDMR）靶向基因显著富集于各亚型起源的小脑发育早期细胞类型标记物：G3-MB中富集RLSVZ（菱唇亚脑室区）和早期UBC（单极刷细胞）标记物，G4-MB中富集早期UBC和晚期UBC标记物（图1E）。这些F-seDMR靶向的胚胎小脑标记物可有效区分G3和G4亚型。通路分析显示，hypo-F-seDMR靶向基因富集于干性维持、WNT信号、TGF-β信号等肿瘤自我更新相关通路（图1F）。上述结果表明，SE低甲基化通过维持发育早期转录程序，将肿瘤细胞锁定在祖细胞样状态，促进肿瘤发生。

 

（3）祖细胞样肿瘤细胞特异的SE低甲基化增加G3-MB染色质可及性

为阐明SE低甲基化的功能，研究对G3-MB样本进行snATAC-seq以分析染色质可及性（Chromatin Accessibility, CA）。发现约65%的功能性seDMRs（F-seDMRs）位于开放染色质区域（图2A），且低甲基化F-seDMRs的CA显著高于高甲基化F-seDMRs（图2B-C），表明低甲基化直接促进染色质开放。

通过snRNA-seq将肿瘤细胞分为祖细胞样（prog-like）、周期样（cycling）和分化神经元样（diff-like）群体。细胞类型特异性差异可及峰分析发现，祖细胞样肿瘤细胞特异的开放染色质区域（peaks）主要位于低甲基化的SEs内（63%），而分化样细胞的开放区域则更多位于高甲基化启动子区（图2D）。例如，Otx2 SE低甲基化与其在肿瘤起始阶段（祖细胞样细胞）的高染色质可及性密切相关（图2D-E）。上述研究结果将特定的表观遗传状态（SE低甲基化）与特定的肿瘤细胞状态（干性/祖细胞状态）进行关联。

 

图2：Otx2枢纽增强子低甲基化作为G3/4-MB的预后指标

 

 

（4）Otx2枢纽增强子低甲基化可作为预后指标

 

研究进一步利用snATAC-seq数据和eNET算法构建了增强子-基因互作网络，发现Otx2、Olfm1和Ddx31等基因受“枢纽增强子”网络调控，且这些枢纽增强子区域显著富集低甲基化F-seDMRs（图2G-H）。其中，Otx2增强子网络尤为复杂，其核心区域（如E33）显著低甲基化（图2I）。临床数据分析表明，Otx2 SE（E33）低甲基化与患者不良预后显著相关。根据E33甲基化水平将G3-MB或G3/G4-MB患者分组，低甲基化组患者总生存期更短（图2K-L）。多因素分析证实，E33低甲基化是不依赖于性别、年龄、转移状态和亚型的独立预后因子（图2M）。上述研究结果验证了Otx2 SE低甲基化作为G3/4-MB的预后生物标记物。

 

 

 

（5）OTX2正反馈自调控促进G3-MB进展

 

鉴于Otx2在G3-MB中的关键作用，研究探索其调控机制。ChIP-seq和Hi-C数据证实OTX2蛋白结合在其自身的SE（E33）上，且该区域与Otx2启动子在空间上邻近，形成染色质环路（图3A）。报告基因实验表明，含有OTX2结合位点的野生型E33片段能显著增强Otx2启动子活性，而突变该位点则活性缺失（图3B-D），证明OTX2通过结合自身SE形成正反馈自激活环路。功能实验显示，破坏此环路（E33突变）能抑制细胞增殖、侵袭，促进分化（图3E-G），并在小鼠原位移植瘤模型中显著抑制肿瘤生长、延长生存期（图3H-J）。这确立了Otx2 E33正反馈自调控对维持G3-MB恶性表型的关键作用。

 

 

图3：OTX2正反馈自调控促进G3-MB进展

 

 

（6）OTX2招募TET3介导Otx2超级增强子去甲基化

 

接下来，研究人员深入探索了E33低甲基化的分子机制。转录因子富集分析显示OTX2在hypo-F-seDMR区域显著富集（图4A）。对去甲基化酶TET家族的分析发现，TET3在G3-MB中高表达，且其表达与Otx2表达正相关（图4B）。在G3-MB中，TET3高表达亚组表现出更高的染色质可及性（图4C）。功能实验证实敲低TET3会导致Otx2 SE区域甲基化水平升高，同时Otx2表达下降（图4E-F），而过表达Otx2可逆转TET3抑制增殖缺失，表明TET3通过调控Otx2 SE甲基化影响其表达。CUT&Tag-seq和ChIP-seq显示TET3与OTX2在Otx2 SE区域共定位（图4G-K），且TET3结合位点与OTX2结合位点显著重叠（图4L），这些重叠区域DNA甲基化显著降低。ChIP-qPCR证实Tet3敲低显著减少OTX2在E33的结合（图4H）。Co-IP验证OTX2与TET3物理互作，且E33突变可减少互作（图4I-J）。TET3依赖的OTX2靶基因富集于干性、分化、细胞周期、炎症和转移相关通路（图4M）。上述结果表明，OTX2通过招募TET3至其自身的SE区域，介导TET3进行位点特异性去甲基化，从而放开染色质、激活自身转录，形成“去甲基化-染色质开放-OTX2表达上调”的正反馈环路。

图4：TET3被OTX2招募以对Otx2超级增强子进行去甲基化

 

 

（7）TET3下调在体内抑制G3-MB进展

 

基于上述机制，研究团队开发了靶向治疗策略。构建了负载TET3抑制剂Bobcat339或siTET3的脂质纳米颗粒（LNP）系统，并证实其能有效递送至脑肿瘤部位（图5A-F）。在3D类器官和原位移植瘤（包括细胞系来源和PDX来源）模型中，LNP@Bobcat339或LNP@siTET3处理均能显著抑制肿瘤细胞活力、减少肿瘤体积、延长小鼠生存期（图5G-K）。治疗后肿瘤组织增殖标记物（Ki-67）下降，分化标记物（NeuN）上升，侵袭标记物（MMP9）减少（图5J）。上述结果证明了靶向TET3-Otx2 SE轴作为G3-MB治疗的可行性。

 

图5：纳米颗粒负载抑制剂或siTET3抑制G3-MB进展

 

 

结论和启示

 

本研究通过WGBS分子机制探索和多重实验验证揭示了Otx2 SE低甲基化是G3-MB的关键表观遗传标记物和预后因子。OTX2通过招募TET3对其自身SE进行去甲基化，形成正反馈环路，驱动肿瘤干性和进展。利用LNP递送TET3抑制剂或siRNA能有效抑制肿瘤生长，为G3-MB提供了新的机制认知、预后工具和极具转化潜力的治疗策略。

 

WGBS在本研究中的核心作用

 

本研究始于对189例MB样本的WGBS分析，系统性地比较各亚型、各基因组区域的甲基化差异，从而将目光聚焦于此前容易被忽略的增强子区域，并精准定位Otx2 SE这一关键调控元件的甲基化状态，将其与预后、机制和治疗靶点紧密相连，贯穿了从基础发现到转化研究的全过程。

 

 

参考文献：Chen X,…et al.Targeting TET3 suppresses group 3 medulloblastoma stemness and progression via impairing hypomethylation of Otx2 super-enhancer. Cell Rep Med. 2025 Dec 2:102474.doi: 10.1016/j.xcrm.2025.102474.