NAR/IF13.1：ChIP-seq表观多组学揭示MORC2蛋白在雄性生殖细胞发育(精子发生)过程中的双重调控机制

近日，宾夕法尼亚大学与安徽医科大学国家卫生健康委配子及生殖道异常研究重点实验室、南京医科大学生殖医学与子代健康全国重点实验室团队合作，在《Nucleic Acids Research》期刊发表题为“Stage-dependent dual mechanisms of MORC2 in retrotransposon silencing and sex chromosome inactivation in germ cells”科研成果。研究通过表观多组学分析系统揭示了转录调控因子MORC2在小鼠雄性生殖细胞发育过程中的阶段依赖性双重功能：在胚胎期生殖细胞中，MORC2与MORC1形成复合体协同作用并介导LINE1和IAP逆转座子的DNA甲基化修饰，继而维持转座子沉默；然而，出生后，处于减数分裂粗线期的生殖细胞中，MORC2则转换功能，通过与SETDB1相互作用，在X染色体基因启动子区域富集H3K9me3修饰，导致减数分裂性染色体失活（MSCI），从而确保减数分裂正常进行。这一双重机制的发现，解决了长期以来MORC2在生殖细胞中体内功能不明的科学问题，也为理解雄性不育的分子机制提供了新的理论依据。

 

英文标题：Stage-dependent dual mechanisms of MORC2 in retrotransposon silencing and sex chromosome inactivation in germ cells

译文标题：MORC2在生殖细胞逆转座子沉默和性染色体失活中的阶段依赖性双重机制

发表时间：2025年12月18日

发表期刊：Nucleic Acids Research

影响因子：IF13.1/Q1

技术平台：ChIP-seq、CUT&RUN、RNA-seq、BS

作者单位：宾夕法尼亚大学、安徽医科大学、南京医科大学等

DOI:10.1093/nar/gkaf1362

 

本研究揭示了MORC2在精子发生过程中的两种不同功能。胚胎期生殖细胞MORC2特异性失活导致雄性生殖细胞中LINE1和IAP逆转座子沉默失败、减数分裂阻滞和雄性不育。MORC2敲除睾丸中的LINE1和IAP元件低甲基化，为其激活提供了分子解释。相比之下，出生后减数分裂前的MORC2敲除导致会MSCI功能失败。具体而言，MORC2通过H3K9me3沉积在减数分裂细胞中结合基因启动子，以抑制常染色体和性染色体连接基因转录，且对性染色体连锁基因具有优先效应。进一步研究表明，MORC2在睾丸中与MORC1和SETDB1互作。本研究结果证明MORC2在雄性生殖细胞中发挥阶段依赖性双重功能：通过分别与MORC1和SETDB1结合，在胚胎期细胞中实现逆转座子沉默，在减数分裂期细胞中实现MSCI。

图形摘要

 

易小结

本研究重点揭示了生殖细胞发育过程中表观遗传调控网络的精确性与动态性，阐明了同一染色质重塑因子在不同发育阶段的“功能转换”系统机制，为理解哺乳动物配子发生与基因组稳定性维持提供了全新视角。

技术层面，ChIP-seq技术的应用为解析染色质修饰的动态分布提供了高分辨率图谱，充分展现ChIP-seq在解析DNA-蛋白互作中的重要作用，为未来在发育生物学、表观遗传学等领域开展机制探索提供了方法学参考。

研究方法

（1）动物模型构建

•  Morc2条件性敲除小鼠：利用Morc2条件性敲除小鼠模型，分别获得Morc2^DcKO（胚胎期敲除）和Morc2^ScKO（出生后敲除）小鼠模型，从而在时间上区分MORC2在减数分裂前和减数分裂期功能。
•  3×FLAG-Morc2敲入小鼠：在Morc2第一外显子插入3×FLAG标签，用于后续免疫沉淀和CUT&RUN实验。

（2）组织学与表型分析

•  通过组织学染色（如H&E）、免疫荧光染色、精子计数、生育力测试等，系统评估了敲除小鼠的睾丸形态、减数分裂进程和生殖能力。

（3）生化与细胞生物学实验

•  免疫共沉淀（Co-IP）和Western Blot验证MORC2与MORC1、SETDB1等蛋白的互作。
•  免疫荧光/免疫组化分析SETDB1等蛋白的亚细胞定位变化。
•  染色质构象分析（如3D-FISH）辅助评估性染色体状态。
•  亚细胞组分分离：将P18睾丸分离为胞质、可溶核组分和染色质不溶组分。
•  qRT-PCR：检测LINE1、IAP逆转座子及对照36B4的表达水平。

（4）表观多组学分析

•  染色质免疫共沉淀测序 (ChIP-seq)：从8-12周龄小鼠睾丸中纯化粗线期精母细胞进行H3K9me3 ChIP-seq分析，检测H3K9me3（抑制性标记）的基因组分布变化。
•  CUT&RUN：3×FLAG-Morc2小鼠粗线期精母细胞进行CUT&RUN分析，鉴定MORC2结合的基因组位点；同时对P12睾丸（含精原细胞和早期减数分裂细胞）进行CUT&RUN分析。
• 亚硫酸盐测序（BS）：对P10睾丸基因组DNA进行亚硫酸盐测序，检测L1MdA_I LINE1家族和IAP LTR的CpG甲基化水平。
•  RNA测序 (RNA-seq)：对Morc2^ScKO和对照粗线期精母细胞、P10 Morc2^DcKO和对照睾丸组织进行转录组分析，鉴定差异表达基因，特别是逆转座子和性染色体连锁基因的表达变化。

 

结果图形

（1）MORC2在生殖细胞中与染色质的结合

为研究MORC2在生殖细胞中的作用，研究团队首先检测了其表达，发现MORC2在小鼠组织中普遍表达，且在睾丸和肌肉中含量最高（图1A）。Western blot分析显示，MORC2在P7睾丸（含精原细胞）中已有表达，但在P14睾丸（首次出现粗线期精母细胞）中表达量急剧上升（图1B）。亚细胞组分分离实验表明，MORC2存在于可溶性核组分和染色质不溶组分中，但不存在于胞质组分，证实其为染色质结合蛋白（图1C）。免疫荧光分析显示MORC2定位于生精细胞和Sertoli细胞的细胞核中（图1D）。在分期的生精小管中，MORC2信号强度随生殖细胞发育逐渐降低：在精原细胞至偶线期精母细胞中高表达，粗线期、双线期细胞和圆形精母细胞中中等表达，在延长和浓缩期精母细胞中表达降低，在延长精母细胞中不表达（图1E）。上述研究结果表明MORC2可能在几乎所有雄性生殖细胞中发挥功能。

 

图1：MORC2与男性生殖细胞中的染色质相关

 

 

（2）MORC2对雄性减数分裂至关重要

 

表型分析发现，生殖细胞特异性敲除 Morc2 导致雄性小鼠完全不育（图2）。睾丸组织学显示，突变体小鼠的减数分裂在粗线期后严重受阻，生精小管内仅存在少量减数分裂后细胞，且完全缺乏成熟精子。这表明MORC2是雄性减数分裂正常完成所必需的因子。

 

 

 

 

图2：MORC2对雄性减数分裂和生育至关重要

 

 

（3）Morc2敲除生殖细胞中LINE1和IAP逆转座子激活

 

为确定MORC2是否在生殖细胞中发挥类似沉默逆转座子的作用，研究者通过免疫荧光检测逆转座子。结果发现在P18 Morc2^DcKO睾丸中，LINE1在精母细胞中显著上调，但在精原细胞中不上调（图3A）；而IAP在精原细胞和精母细胞中均上调（图3B）。在P0（新生）睾丸中，LINE1和IAP在Morc2^DcKO性原细胞中均上调（图3C）。qRT-PCR分析显示，LINE1和IAP在P10、P14和P60 Morc2^DcKO睾丸中均上调（图3F）。LINE1 ORF1蛋白在P10和P14 Morc2^DcKO睾丸中显著增加（图3G）。piRNA通路相关蛋白MIWI2和MILI的亚细胞定位在Morc2突变与对照性原细胞中保持不变，提示逆转座子激活不依赖于piRNA通路（图3D-E）。亚硫酸盐测序（BS）显示，P10 Morc2^DcKO睾丸中L1MdA_I的CpG甲基化水平从对照的92%降至41%，IAP从85%降至43%（图3H）。RNA-seq分析显示，P10 Morc2^DcKO睾丸中多个进化上年轻的TE亚家族上调（图3I）。这些结果证明MORC2对雄性生殖细胞中LINE1和IAP的DNA甲基化及沉默至关重要。

 

图3：Morc2突变体睾丸中LINE1和IAP逆转座子激活

 

（4）MORC2在睾丸中与MORC1结合

鉴于MORC1是已知的睾丸特异性逆转座子抑制因子，且与MORC2同属MORC家族，研究人员通过免疫共沉淀实验检测两者是否存在相互作用。结果显示，在小鼠睾丸裂解液中，内源性MORC2与MORC1可被相互共沉淀，其中MORC1介导睾丸中逆转座子沉默（图4）。Co-IP分析进一步确认了这一互作关系（图4B-C）。上述结果证明MORC2与MORC1在睾丸中形成复合体。为此，研究团队提出MORC2在减数分裂前通过与MORC1协同作用，共同维持逆转座子的沉默状态。

 

 

图4：MORC2与MORC1在睾丸中形成复合体

 

 

（5）MORC2与粗线期精母细胞的基因启动子结合

 

为鉴定MORC2结合的基因组位点，研究者使用3×FLAG-Morc2小鼠进行CUT&RUN实验，共鉴定到6599个峰，其中47.5%位于转录起始位点（TSS）1kb范围内的启动子区域，其他主要结合区域为远端基因间区（21.88%）和第一外显子（10.74%）（图5A-B）。MORC2结合常染色体和性染色体连锁基因的启动子（图5B）。GO分析显示MORC2靶基因富集于染色质重塑、精子发生和转录调控等关键生物学过程（图5C）。值得注意的是，230个MORC2靶基因为单外显子基因（图5D）。MORC2靶基因在各染色体上分布均匀（图5E）。MORC2结合基因组靶标中最富集的序列基序与MYBL2、MYBL1和MYB转录因子的共有序列匹配（图5F）。这些CUT&RUN结果表明MORC2通过在启动子处结合调控粗线期精母细胞的转录。

 

图5：MORC2优先结合粗线期精母细胞的启动子区域

 

 

（6）出生后Morc2敲除导致减数分裂缺陷和减数分裂后阻滞

 

为确定MORC2在精母细胞和精细胞中的潜在作用，研究者构建了Morc2^ScKO小鼠（Stra8-GFPCre介导的出生后敲除）。Stra8-GFPCre在减数分裂前精原细胞中表达，不在前精原细胞中表达。结果显示Morc2^ScKO睾丸明显小于对照（图6A-B），缺乏附睾精子（图6C）。Western blot显示Morc2^ScKO睾丸中MORC2蛋白几乎缺失（图6D）。

 

通过时间进程分析，研究者发现 Morc2 敲除后，生殖细胞发育在出生后早期（约14天龄，对应粗线期阶段）就开始出现异常，最终完全阻滞在减数分裂后的圆形精子细胞阶段，无法形成为长形精子细胞和精子（图6E-H）。这明确了MORC2的功能主要作用于减数分裂及减数分裂后早期。

 

图6：出生后Morc2敲除导致减数分裂缺陷和减数分裂后精子发生阻滞

 

 

（7）MORC2抑制转录，且对X连锁基因有偏好性

 

为评估MORC2敲除对减数分裂细胞转录组的影响，研究者对对照和Morc2^ScKO粗线期细胞进行RNA-seq分析。在Morc2^ScKO粗线期细胞中鉴定到3574个上调的差异表达（DE）参考基因，仅312个下调（图7A），且上调的蛋白编码基因高度富集于转录调控（图7B）。下调的DE基因在各染色体上随机分布，但上调蛋白编码DE基因定位于X染色体（图7C）。GO分析显示，上调的X连锁基因富集于减数分裂细胞周期、精子细胞发育和转录负调控（图7D）。

 

为分析造成X染色体上的基因显著上调的原因，研究者分析了MORC2 CUT&RUN靶基因与DE基因的重叠。结果显示仅37个MORC2 ChIP靶基因（0.8%）下调，而383个（8.7%）上调，提示MORC2可能直接抑制这383个基因的转录（图7E）。虽然MORC2 CUT&RUN靶基因在各染色体上随机分布（图5E），但383个MORC2结合的上调基因中有129个（34%）为X或Y连锁（图7F）。重叠的性染色体连锁基因的GO分析显示富集于减数分裂细胞周期、精子细胞发育、转录调控和染色质组织（图7G）。这些结果提示MORC2在粗线期精母细胞中抑制转录，特别是X连锁基因的转录。

 

 

图7：MORC2在粗线期精母细胞中抑制转录

 

（8）Morc2敲除的粗线期细胞中性染色体范围H3K9me3水平降低

 

为研究MORC2在粗线期细胞中转录抑制的机制，研究者对抑制性组蛋白修饰H3K9me3进行了检测分析。Western blot显示，对照和Morc2^ScKO粗线期细胞以及睾丸中H3K9me3的丰度类似（图8A）。随后，研究者使用对照和Morc2^ScKO睾丸纯化的粗线期细胞进行H3K9me3 ChIP-seq。分析结果显示在对照细胞中，H3K9me3信号在TSS周围达到峰值，但也沿基因体积累；在Morc2敲除细胞中，H3K9me3沿基因体显著降低，在TSS周围降低更明显（图8B）。

 

绘制所有编码基因显示，Morc2敲除细胞中性染色体的H3K9me3水平降低比常染色体更为显著（图8C）。虽然常染色体基因和X连锁基因的H3K9me3降低都集中在TSS周围，但在Morc2敲除的粗线期细胞中，X和Y染色体上还存在染色体范围H3K9me3降低（图8C）。同样地，Morc2敲除细胞中启动子H3K9me3标记降低（图8D）。共有1458个基因在Morc2敲除粗线期精母细胞中H3K9me3降低且表达上调，其中279个（19%）为X连锁，8个为Y连锁（图8E）。GO富集分显示287个性染色体连锁基因表现出显著的转录负调控（图8F）。这些ChIP-seq结果证明，性染色体上H3K9me3缺失导致Morc2敲除粗线期中性连锁基因表达增加。

 

图8：MORC2敲除优先导致粗线期细胞中性染色体上的H3K9me3缺失

 

（9）MORC2敲除导致SETDB1从细胞核向细胞质转位

已知H3K9me3主要由组蛋白甲基转移酶SETDB1催化沉积。先前研究显示SETDB1敲除导致粗线期精母细胞中上调基因多于下调基因（图9A）。值得注意的是，Morc2^ScKO和Setdb1^cKO粗线期细胞中的上调基因重叠，且X或Y连锁上调基因更为重叠（图9B-C）。Co-IP显示MORC2与睾丸中的SETDB1相关（图9D）。HEK293T细胞中的共转染和Co-IP验证了MORC2与SETDB1的相关性（图9E）。SETDB1在野生型粗线期细胞中为核定位，但在Morc2敲除的粗线期细胞中显著错位至细胞质（图9F）。这表明MORC2可能通过将SETDB1锚定在细胞核内（特别是性染色质上），来确保其催化产生H3K9me3，从而执行转录沉默功能。

 

 

图9：MORC2与SETDB1协同调控性染色体沉默

 

 

结论和启示

 

本研究通过多组学联合分析，揭示了MORC2在雄性生殖细胞发育中的阶段依赖性双重功能机制：在胚胎期通过MORC1介导逆转座子DNA甲基化沉默，在减数分裂期通过SETDB1介导性染色体H3K9me3修饰依赖性转录沉默。ChIP-seq和CUT&RUN技术的联合应用为解析染色质结合蛋白的基因组靶点和表观遗传修饰分布提供了高分辨率图谱，是揭示生殖细胞表观遗传调控网络的有力工具。

 

 

参考文献：Kang Z, Guo R, Han S, Yang F, Zhang J, Wang Y, Nelson KA, Nallamala VC, Leu NA, Li Z, Liu J, Liang H, Lan Y, Faustino A, Tang HY, Modzelewski AJ, Ye L, Wang PJ. Stage-dependent dual mechanisms of MORC2 in retrotransposon silencing and sex chromosome inactivation in germ cells. Nucleic Acids Res. 2025 Nov 26;53(22) doi: 10.1093/nar/gkaf1362.