易基因RNA-BisSeq助力揭示m5C甲基化调控病毒侵染与作物产量双重机制

近日，宁波大学姜瑶瑶博士后和刘芃副研究员为共同第一作者，宁波大学陈剑平院士、羊健教授和河南农业大学陈锋教授为共同通讯作者，在《Science Advances》期刊发表题为“Enhancing plant antiviral responses and productivity through the elimination of m5C methyltransferase”的科研成果。研究揭示了小麦NOP2/Sun RNA甲基转移酶2（TaNSUN2） 作为RNA 5-甲基胞嘧啶（m5C）甲基转移酶，在中国小麦花叶病毒（CWMV） 侵染过程中的关键作用机制。易基因科技为本研究提供m5C RNA甲基化检测（RNA-BisSeq）技术服务，在植物RNA病毒中精准鉴定出功能性m5C修饰位点，助力揭示RNA甲基转移酶TaNSUN2在病毒侵染过程中的作用及其分子机制。

研究发现，TaNSUN2被宿主因子TaeEF1A招募至病毒复制复合体（VRCs），通过催化病毒RNA的m5C修饰，增强病毒RNA的稳定性、翻译效率以及病毒组装，从而促进侵染。更重要的是，研究团队在抗病小麦品种中鉴定出TaNSUN2的自然变异体TaNSUN2R，其无法与TaeEF1A互作导致病毒RNA的m5C修饰水平降低，从而赋予小麦抗病性。研究人员通过敲除TaNSUN2后发现不仅增强了小麦对CWMV的抗性，还意外发现籽粒的重量与产量显著提升，实现“抗病增产”的双重改良。该研究为RNA修饰调控植物-病毒互作提供了全新机制，并为小麦抗病育种提供了宝贵的基因资源。

 

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英文标题：Enhancing plant antiviral responses and productivity through the elimination of m5C methyltransferase

译文标题：敲除m5C甲基转移酶可增强植物病毒抗性与产量

发表时间：2026-3-11

发表期刊：Science Advances

影响因子：IF12.5/Q1

技术平台：RNA-BisSeq（易基因金牌技术）

作者单位：宁波大学、河南农业大学

DOI:10.1126/sciadv.aea4046

易小结

本研究是植物RNA表观转录组学与植物病毒学交叉领域的重大突破。阐明了植物m5C修饰在RNA病毒侵染中的完整分子机制，将宿主因子、RNA修饰、病毒复制与宿主抗性串联成一个清晰的调控网络。

研究中RNA-BisSeq技术（易基因金牌产品）的成功应用，精准绘制了病毒及宿主RNA m5C修饰图谱，极大地推动了表观转录组学在非模式生物和农业逆境生物学中的深入应用。

研究方法

（1）植物材料

  • 本氏烟（Nicotiana benthamiana）和小麦（Triticum aestivum）品种Fielder（CWMV感病）

（2）载体构建与遗传转化

  •  构建用于蛋白互作（Y2H、LCI、pull-down）、亚细胞定位（GFP/RFP融合）、蛋白表达（GST/His标签）和病毒侵染（CWMV及其突变体）等载体。
  • 将TaNSUN2过表达载体和CRISPR-Cas9基因编辑载体导入小麦未成熟胚，获得转基因和基因敲除（KO）小麦株系。

（3）病毒接种与农杆菌浸润

  • 将CWMV的体外转录本（IVT）RNA接种至小麦幼苗叶片。
  • 将CWMV侵染性克隆或其他表达载体导入本氏烟叶片，进行瞬时表达和病毒侵染。

（4）RNA m5C修饰检测与分析

  • Dot-blot：检测全局或特定RNA的m5C水平。
  •  LC-MS/MS：通过液相色谱-串联质谱定量分析m5C的相对含量。
  •  RNA-BisSeq（RNA亚硫酸盐测序）：将纯化的CWMV病毒粒子RNA进行亚硫酸盐处理并进行高通量测序，精准鉴定病毒基因组上的m5C修饰位点及其甲基化比率。

（5）蛋白互作分析

  • 酵母双杂交（Y2H）：验证TaNSUN2与病毒蛋白或宿主因子的互作。
  • 分裂荧光素酶互补成像（LCI）：本氏烟叶片验证TaNSUN2与TaeEF1A蛋白互作。
  • Pull-down & Co-IP：体外和体内验证蛋白互作。
  • RIP-qPCR：验证蛋白与RNA的体内结合或RNA修饰水平。
  • MST：定量测定蛋白-RNA结合亲和力

（6）RNA结构与功能分析方法

  • SHAPE-MaP：分析m5C修饰对RNA二级结构的影响
  • 结构预测：RNA结构预测（RNAfold）及RNase T1、S1、V1结构探测
  • 体外甲基化实验：使用重组GST-TaNSUN2蛋白和3H-SAM进行放射性甲基化验证
  • 转录抑制实验：检测RNA半衰期
  • 多核糖体分析：评估翻译效率

（7）遗传学与大田试验

  • TILLING：筛选TaNSUN2突变体（m-tansun2，G203A突变）
  •  全基因组关联分析（GWAS）：660K和90K SNP芯片对406份小麦品种进行抗病性关联分析
  •  多点田间试验：连续4年（2021-2024）的田间抗性鉴定和农艺性状考察

 

结果图形

 

（1）TaNSUN2是推定的mRNA m5C甲基转移酶

 

通过系统发育分析，发现小麦TaNSUN2与人类NSUN2、拟南芥TRM4B和水稻OsNSUN2高度同源（图1A）。qRT-PCR分析显示，在CWMV侵染后，只有TaNSUN2-5A同源基因的表达被特异性显著诱导（图1B），提示TaNSUN2-5A在病毒应答中起关键作用。亚细胞定位显示TaNSUN2-GFP主要定位于细胞核（图1D），与mRNA甲基化发生位点一致。功能实验证明，在小麦原生质体中过表达TaNSUN2可提高总mRNA m5C修饰水平（图1E），而而BSMV介导的基因沉默则显著降低m5C水平（图1F-G）。关键的体外甲基化实验证实，重组TaNSUN2-GST蛋白可在含经典m5C基序的RNA探针上催化m5C修饰，而催化位点突变体（C285/335A）完全丧失甲基转移酶活性（图1H-I）。值得注意的是，TaNSUN2不具备m5A修饰能力，表明其底物特异性。这些证据共同确立了TaNSUN2是一个具有催化活性的m5C甲基转移酶。

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图1：TaNSUN2是一个推定的mRNA m5C甲基转移酶

 

（2）TaNSUN2通过其RNA m5C甲基转移酶活性促进CWMV侵染

 

从KN9204 TILLING数据库获得的TaNSUN2功能缺失突变体m-tansun2（G203A导致提前终止）表现出对CWMV的抗性增强，田间病圃中症状减轻，病毒RNA和CP积累量显著降低。相反，过表达TaNSUN2的L3和L6转基因小麦株系（表达量升高56-50倍）在实验室和田间条件下均表现出更严重的病害症状（花叶），病毒积累量显著增加（图2A-D）。

 

CRISPR-Cas9敲除实验显示，仅敲除TaNSUN2-5A（KO-1、KO-2）即可显著降低病毒侵染，而敲除-5B或-5D无显著效应，表明TaNSUN2-5A敲除对CWMV表现出显著增强的抗性（图2F-H）。关键验证实验表明，在KO-1原生质体中回补野生型TaNSUN2-RFP可恢复病毒积累，而回补酶活缺失突变体TaNSUN2C285/335A-RFP则不能（图2I-J），证实TaNSUN2的促病毒作用严格依赖其甲基转移酶活性。

 

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图2：TaNSUN2促进CWMV侵染

 

（3）TaNSUN2增强CWMV RNAs的m5C修饰

 

为探究TaNSUN2促病的直接靶标，研究团队检测了病毒RNA的m5C修饰。Dot-blot和Northern blot结果显示，病毒粒子中的RNA确实存在m5C修饰，且其水平在TaNSUN2过表达株系中升高，在KO株系中降低（图3A-B）。为精确鉴定修饰位点，研究者采用了核心的RNA-BisSeq技术，通过将来源于不同小麦背景的病毒RNA进行亚硫酸盐测序，并与无修饰的体外转录（IVT）病毒RNA比对分析，共鉴定出158个m5C位点。其中，RNA1的C4438位点和RNA2的C3322位点受TaNSUN2调控最为显著，在过表达株系中甲基化比率升高，在KO株系中降低（图3C）。进一步的m5C-IP-qPCR和RIP-qPCR实验证实，这两个位点所在的片段（S1和S2）不仅是m5C修饰的热点区域，也是TaNSUN2蛋白直接结合的靶标（图3D-E）。MST和RNA pull-down实验也体外验证TaNSUN2与S1、S2片段的特异性结合（图3F-G）。其中，RNA-BisSeq技术，首次在植物RNA病毒基因组上精准定位了由宿主甲基转移酶介导的功能性m5C修饰位点，为后续的机制解析提供了精确的靶标。

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图3：TaNSUN2提高CWMV RNA中的m5C修饰水平

 

 

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图S3：高通量亚硫酸盐测序流程及m5C在CWMV RNA中的分布

（4）CWMV m5C位点失活导致病毒RNA不稳定

为探究特定m5C位点的功能，研究构建了CWMV RNA1的C4438U突变体（CWMVm1）和RNA2的C3322G突变体（CWMVm2）。LC-MS/MS分析证实，这些突变体病毒RNA m5C修饰水平显著降低（图4A）。MST实验表明，突变减少TaNSUN2与病毒RNA的结合亲和力（图4C）。功能研究表明，突变体病毒RNA显著降低病毒RNA的稳定性（图4D）和翻译效率（图4E）。接种实验显示，在感病小麦的对照Fielder中，接种突变病毒（CWMVm1/m2）后，植株症状更轻，病毒RNA和CP积累水平显著低于野生型病毒（图4F-H）。然而，当在TaNSUN2敲除（KO-1）后接种时，野生型和突变病毒的积累水平无显著差异（图4I-K）。这些结果证明，TaNSUN2介导的C4438和C3322位点的m5C修饰，对于维持病毒RNA的稳定性和高效翻译至关重要，是病毒成功侵染的关键。

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图4：CWMV m5C位点突变抑制病毒侵染

 

（5）TaNSUN2介导的m5C修饰参与病毒生命周期

接下来研究团队深入探究TaNSUN2如何进入病毒复制场所并影响病毒复制。共聚焦显微镜观察发现，在CWMV感染时，TaNSUN2会从细胞核重新定位到细胞质中，并与病毒复制复合体（VRCs）的标志物B2-GFP共定位（图5A-B）。通过Y2H和LCI筛选，研究者发现TaNSUN2并不直接与病毒蛋白互作，而是与宿主延伸因子TaeEF1A发生互作（图5C-D）。重要的是，当沉默本氏烟中的eEF1A（NbeEF1A）后，TaNSUN2无法再被招募至VRCs（图5E），表明TaeEF1A是将TaNSUN2招募到VRCs的关键接头蛋白。

MST实验显示，m5C修饰能增强TaeEF1A与病毒RNA 3’UTR的结合（图5F）。此外，m5C修饰还能增强病毒CP蛋白与RNA的结合（图5G-H）, 有利于病毒颗粒的组装。最后，通过RNA结构探测和SHAPE-MaP分析，研究团队发现m5C修饰会诱导病毒RNA局部二级结构变化（图5I-K），这可能是其增强与宿主蛋白互作的潜在结构基础。因此，TaNSUN2通过TaeEF1A进入VRCs，介导病毒RNA m5C修饰发生变化，进而改变RNA结构、稳定RNA、促进翻译、并协助病毒组装，从而全面促进病毒生命周期。

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图5：TaeEF1A将TaNSUN2招募至VRCs

 

（6）TaNSUN2自然变异体赋予小麦对CWMV侵染的抗性

 

通过对406个小麦品种的TaNSUN2基因序列分析，发现了5个非同义SNP，并定义了两种主要单倍型：感病单倍型TaNSUN2S和抗病单倍型TaNSUN2R（图6A-B）。GWAS分析在两个独立群体中均检测到TaNSUN2与CWMV抗性的显著关联（图6C）。功能分析表明，TaNSUN2R蛋白因无法与TaeEF1A互作（图6D-E），因此在病毒侵染时不能被招募到复制复合体（VRCs）中（图6F）。导致病毒RNA的m5C修饰水平降低（图6H-K）：在抗病品种（如CH-17, CH-47, CH-186）中，病毒RNA的m5C修饰水平显著低于感病品种（图6H）；定点突变分析表明，5个SNP位点共同促进这种抗性表型（图6I-K）。携带TaNSUN2R或相应突变体的原生质体中，病毒RNA稳定性下降（图6L），最终使携带该变异体的植株表现出对CWMV的抗性（图6G）。上述研究结果鉴定出天然抗病等位基因，并揭示其通过破坏“病毒招募通路”来实现抗性的分子机制。

 

 

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图6：TaNSUN2自然变异赋予小麦对CWMV的抗性

 

（7）敲除TaNSUN2提高籽粒品质

一个突破性的发现是，敲除TaNSUN2（特别是KO-1和KO-2株系）在增强抗病性的同时，还改善了农艺性状。在CWMV感染的田间试验中，KO株系与对照Fielder在株高、穗长等性状上无显著差异（图7A-F），但其千粒重显著增加（例如增加约5.9g）（图7G），籽粒宽度和长度也显著增大（图7H-K），最终导致单株产量和单位面积产量显著提升（图7L-M）。研究还发现，三个同源基因功能有分化：TaNSUN2-5A主要参与病毒响应和籽粒发育，其敲除带来抗病增产；而TaNSUN2-5B主要调控根长，其敲除会导致根变短。这种功能分化作用表明靶向敲除TaNSUN2-5A是培育“抗病增产”作物品种的理想靶标。

 

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图7：T3代KO-1和KO-2植株农艺性状的田间评估

 

结论和启示

 

本研究揭示了小麦m5C甲基转移酶TaNSUN2在CWMV侵染中的核心促病机制。病毒通过招募宿主因子TaeEF1A，将TaNSUN2招募至VRCs，对病毒RNA进行m5C修饰，从而稳定RNA且促进翻译和组装。此外，敲除或利用天然存在的功能丧失型等位基因，可有效抑制CWMV侵染，并意外地提高小麦籽粒产量。这一发现不仅阐明了RNA表观修饰在植物-病毒互作中的新机制，也提供了“感病基因敲除实现抗病增产双赢”的育种新思路。

 

RNA-BisSeq在本研究中的重要作用

 

  • RNA-BisSeq在植物RNA病毒基因组水平绘制了单碱基分辨率m5C修饰图谱，鉴定出158个高置信度修饰位点，直接奠定后续功能研究基础。
  • 通过对比过表达株系（L3）、敲除株系（KO-1）和野生型（Fielder）的RNA-BisSeq数据，实现修饰酶与修饰位点的因果关联，这是免疫沉淀类技术无法达到的精度。
  • RNA-BisSeq结合IVT RNA阴性对照和严格的生物信息学过滤，有效排除假阳性位点，确保了数据的可靠性。

 

RNA-BisSeq不仅验证TaNSUN2的酶活功能，更为解析m5C修饰如何调控病毒RNA稳定性、翻译效率和蛋白结合提供了精确的分子坐标。

 

参考文献：Jiang Y, Liu P, Zhang M, Yong B, Yin J, Chen L, Shi C, Li P, Guo Y, Hu H, Feng L, Chen L, Zhang T, Liu J, Zhong K, Zhou X, Chen F, Chen J, Yang J. Enhancing plant antiviral responses and productivity through the elimination of m5C methyltransferase. Sci Adv. 2026 Mar 13;12(11):eaea4046. doi: 10.1126/sciadv.aea4046. 

 

 

 

 

 

 

 

posted @ 2026-03-30 10:04  深圳市易基因科技  阅读(3)  评论(0)    收藏  举报