流式细胞术介绍
流式细胞仪（Flow Cytometer 简称FCM）是一项集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。概括来说，流式细胞术就是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。随着各相关技术的迅速发展，FCM技术已经成为日益完善的细胞分析和分选的工具.
我科于2001年初引进美国B-D公司的双激光四色台式机，FACSCalibur,该机是目前最先进的临床型流式细胞仪，为临床诊断和科研提供了强有力的手段。现将已开展的部分项目介绍如下。
1.淋巴细胞亚群测定
原理: 淋巴细胞分为T淋巴细胞（CD3）、B淋巴细胞（CD19）、NK淋巴细胞（CD16+56）三大群；T淋巴细胞又分为T辅助细胞/诱导细胞（CD4）、T抑制和细胞毒细胞（CD8）；以荧光标记的鼠抗人单克隆抗体来检测以上各群细胞。
临床应用：总的T-淋巴细胞和B-淋巴细胞百分数可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。
了解CD4+和CD8+淋巴细胞的百分数有助于监测患有免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病或有免疫反应的病人的免疫状态。患有先天性或获得性免疫缺陷疾病例如SCID、AIDS的病人体内CD4+细胞亚群的百分率相对降低，而CD8+群体的百分率相对升高。
在一些自身免疫性疾病和免疫反应例如急性GVHD和移植排斥中，T抑制/细胞毒性淋巴细胞所占的比例有可能在正常人的范围之外。在SLE病人中，CD8+淋巴细胞的相对百分比往往会降低，但当使用类固醇药物治疗时，也可能上升。
CD4+/CD8+的比值可以用来评价那些自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态，此外，这一比值还可用来监测骨髓移植病人以免受到急性GVHD的攻击。
研究表明，自然杀伤（NK）淋巴细胞（CD3-CD16+和/或CD56+）能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。
2.HLA-B27测定
原理
将单克隆抗体与外周血共孵育，裂解红细胞，洗涤固定后，上机检测。在检测之前，仪器已经calibration beads和HLA-B27 calibration beads调试成功，并通过试剂批号的后缀确定了decision marker的位置。
HLA-B27软件首先在FSC-FL2的点图上确定CD3强阳性细胞群体的位置，设定一个CD3+T淋巴细胞门，然后再根据FSC设定光散射门，去除FSC过大或过小的细胞，确保门内至少有50%的CD3+T淋巴细胞，这样通过二者的结合，将随后进行的分析严格地定位在T淋巴细胞上。
临床应用：HLA-B27基因属于Ⅰ型MHC基因，基本上表达在机体中所有含核的细胞上，尤其是淋巴细胞的表面有丰富的含量。早在二十多年前，人们就已发现HLA-B27抗原的表达与强直性脊椎炎有着高度相关性，超过90%的强直性脊椎炎患者其HLA-B27抗原表达为阳性，普通人群中仅5-10%的为阳性，而强直性脊椎炎由于其症状与许多疾病相似而难以确诊，因此HLA-B27的检测在病情的诊断中有着重要意义。在脊椎性关节病这一类的疾病中除了强直性脊椎炎以外，还有许多其它的疾病与HLA-B27抗原的表达有着或多或少的相关性，比如说Reiter，s综和症，HLA-B27阳性率为70-90%；银屑病性关节炎，HLA-B27阳性率为50-60%；葡萄膜炎（眼色素层炎），HLA-B27阳性率为40-50%；溃疡性结肠炎伴有关节病，HLA-B27阳性率为5-10%等等，因此HLA-B27的检测在这些疾病的诊断中是一个非常有价值的指标。
3．DNA倍体分析
原理 ModFit LT是由美国Verity Software House公司设计，专门用于流式细胞术中进行细胞周期分析的软件。它通过对DNA含量直方图进行曲线拟合，能快速计算出各种倍体细胞的含量、细胞周期各时相及亚二倍体细胞所占的比例、DNA指数、G0/G1期峰的变异系数等。此外，2.0版本还增加了“同步化分析”和“增殖分析”的功能，可分别进行同步化细胞和增殖细胞的研究。
临床应用：细胞周期分析是细胞生物学、肿瘤学等学科重要的研究及检测指标，大量的文献已证实，DNA细胞周期的分析对反映一个细胞群体的增殖活性具有重要意义，尤其对肿瘤细胞周期的分析，不仅有助于研究药物的作用机理，指导用药，还可评价预后。
4．血小板活化功能测定
原理：早期血小板活化的标志物，即活化的 gpⅡb/Ⅲa复合物（PAC-1），其抗体与活化后血小板膜表面的gpⅡb/Ⅲa复合物纤维蛋白原结合位点相结合。BDIS抗体为IgM型，建议使用PAC-1结合阻断剂RGDS做阴性对照。血小板活化后期的标志物（CD62P），特异地与活化血小板结合。静止血小板胞浆内a颗粒含有CD62P，血小板活化时，颗粒内糖蛋白向膜外释放，血小板表面表达CD62P。
临床应用：血小板活化试验，对于血小板功能，心血管疾病，脑梗塞的研究，糖尿病微血管病变有重要意义。使用流式细胞仪进行多参数分析，可以特异灵敏地检测血小板表面标记，了解血小板的活化状态和反应性，并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、抗血小板治疗病人的筛选及治疗监测、预测并发症等方面有良好的应用前景。
5．白血病免疫分型
原理 用CD45与侧向角（side scatter,SSC），对数取样后可将骨髓细胞清晰地分出淋巴细胞，单核细胞，成熟粒细胞，幼稚细胞和红细胞群，其理论依据是CD45是所有白细胞的抗原。其表达量在淋巴细胞最高，单核细胞，成熟粒细胞，早期造血细胞（blasts）依次减弱。红细胞（中，晚幼红细胞，成熟红细胞）不表达CD45。SSC反映细胞的颗粒性，成熟粒细胞SSC最高，依次为单核细胞，淋巴细胞，blasts，红细胞。以CD45/SSC双参数，对数取样时即可把各细胞群区分出来。FCM分析白血病免疫表型时，测量细胞数量一般在10000～50000细胞之间，而且快速、特异、准确，重复性好，能区分细胞起源、划分其分化发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有重要价值。
临床应用: 白血病,淋巴瘤诊断、分型、愈后监测。
白血病系列分化抗原
T淋巴细胞白血病：CD3、CD5、CD7。
B淋巴细胞白血病：CD10、CD19、CD22。
NK淋巴细胞白血病：CD16、CD56、CD57。
髓系白血病：CD13、CD14、CD33、MPO（髓过氧化物酶）。
红白血病：GlyA（血型糖蛋白A）。
巨核细胞白血病：CD41、CD42、CD61。
6．PNH
原理:阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）是由于缺乏一系列糖化肌醇磷脂结合蛋白（GPI）锚蛋白而引起溶血性贫血。而CD55、CD59均为GPI连接蛋白的特异性标记。PNH患者其红细胞、粒细胞、淋巴细胞表面的CD55、CD59抗原明显减少或消失。
临床应用：PNH时，CD55-/CD59-细胞增多，并可评估疗效。
7．FAS（CD95）/BCL-2（科研用）
原理 BCL-2 凋亡调控基因，定位于细胞线粒体内，是一种阻断凋亡，引发肿瘤的原癌基因。Fas和配体Fasl结合时，可以引发信号传导途经引起肿瘤细胞凋亡，是促凋亡基因。
应用：生物细胞研究，临床和基础研究，药物筛选等。
8.Annexin-v（科研用）
原理：Annexin-v 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一，它是一种磷脂结合旦白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合。细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一，在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由质膜内侧翻向外侧。Annexin-v与PS有高度亲和力。同时使用膜非通透性材料PI，能将凋亡和坏死细胞区别开来。
应用：生物细胞研究，临床和基础研究，药物筛选等。
9.转铁蛋白受体（CD71）
原理: 恶性肿瘤，缺铁性贫血时，血细胞表面转铁蛋白受体增高。以鼠抗人抗体CD71来检测外周血淋巴细胞CD71的表达率。
临床应用：其增高见于恶性肿瘤，缺铁性贫血等。
10.血小板相关抗体检测
原理：ITP的发病机制是机体免疫系统失常，产生血小板自身抗体使血小板过度破坏 .以人血小板免疫羊，产生抗抗体，来检测血小板自身抗体。
临床应用:诊断ITP和评估疗效。
11.CD34绝对值计数（PROCOUNT）
原理
（1）获取：
软件先获取5μl样本，用此数据在FL1（核酸染料）-SSC设一个实时的门，去除碎片，并在此界限设定阈值（实验室报告图1），此门亦用于对照管，故对照管在实验室报告图1上无显示。然后软件获取1000个微球，再按选定的收获界限收获细胞。
（2）、分析：
由于CD34＋细胞相对含量较低，流式细胞学上的特征与其他细胞群体亦有相似之外，所以需要一个利用已知祖细胞特征的多参数设门策略，通过门的集合或逻辑门来有效地除外如粒细胞、单核细胞、碎片等不需要的细胞群体。这种分析方法利用细胞粒度（SSC）、核酸染料表达（FL1）、CD45表达（FL3）、和CD34抗原表达（FL2）的特点帮助区分祖细胞与其他细胞群体。图1为ProCOUNT试剂盒所有的多参数设门方法。首先确认微球群体，因为CD34细胞太少，需依与其他细胞群体关系设定CD45门：以单核细胞群确定门SSC上限，以10%低SSC粒子确定右限。此门去除CD45强阳性细胞。单核细胞还用于FL2-FL3和FL1-FL2图辨别CD34细胞群与其他群体的分界。因碎片已在获取是用阈值去除，故所有非微球粒子均被认为是有核细胞，CD45计数不包括CD45阴性细胞。前两步（
临床应用：骨髓移植，外周血干细胞移植，再障的病程监测等。
12、CD28
CD28是免疫球蛋白超家族成员之一，其分子量为90kD，主要分布在外周血淋巴细胞。
临床意义：
① CD8+CD28+ 是细胞毒性T细胞（Tc）即CTL。CTL具有识别抗原的特性。杀伤具有特定的外来抗原（如病毒感染靶细胞膜表面的病毒抗原）。与自身MHCI类抗原结合的复合物的靶细胞。
② CD8+CD28- 抑制性T细胞（Ts）。Ts细胞不仅对B细胞合
成和分泌抗体有抑制作用。而且对Th 辅助作用。对迟发型超
敏反应以及Tc介导的细胞毒作用都有免疫调节作用。
正常范围：CD8+CD28+：12.23 ±5.13%
CD8+CD28-: 24.10±10.48%
浙公网安备 33010602011771号