肿瘤细胞的冻存和复苏

    细胞存储在液氮中，温度达-196，理论上储存的时间是无线的。细胞冻存和复苏的原则是慢冻快融

细胞冻存步骤：

（1）取生长状态好的细胞消化制成细胞悬液

    【用0.25%胰酶把单层生长细胞消化来，悬液生长的细胞则不需处理】

（2）离心洗涤

     【1000r/min,5min 去除胰酶和旧的培养液】

（3）加含有10%DMSO的冻存夜

     【10%-20%的血清的培养液同时含有10%的DMSO，加入冻存液中细胞最终密度5-10*10的六次方】

（4）加入冻存管

     【2ml的冻存管，应该注明冻存的时间和细胞名称】

（5）加盖

（6）-70放置2-3小时

（7）移入液氮罐

（8）计录

细胞冻存的时候要缓慢，因为细胞在冻存的时候不加任何保护剂直接冻存的时候，细胞内外水分很快形成冰晶会冻坏

细胞内部结构，细胞在冻存时候要尽可能的均匀地减少细胞内水分，目前多采用甘油或DMSO作为保护剂

 

细胞复苏，步骤：

（9）取出冻存管立即放入37度的水 轻轻的摇动

（10）75%的乙醇消毒冻存管开封后将细胞移入离心管加入培养液离心

（11）计数

复苏细胞与冻存的要求相反，应尽快化了，可以尽快让细胞外的结晶在短时间内化掉

（12）接种培养瓶培养