原核蛋白表达纯化丨大肠杆菌蛋白表达丨枯草芽孢杆菌表达丨蛋白分泌表达

原核蛋白表达纯化|大肠杆菌蛋白表达|枯草芽孢杆菌表达|蛋白分泌表达

原核表达系统因其成本低、操作简便和表达效率高，被广泛应用于重组蛋白的生产和研究。其中，大肠杆菌（Escherichia coli，简称 E. coli）是最常见的宿主，拥有成熟的遗传背景和丰富的表达工具，因此成为主流选择。但其缺点在于容易形成包涵体、缺乏翻译后修饰，并且会产生内毒素，在药物和食品相关应用中会带来安全隐患。而枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）因其安全性高、可直接分泌蛋白，逐渐受到重视，尤其适合下游对纯度和安全性要求较高的应用场景。

大肠杆菌表达系统

大肠杆菌在蛋白表达领域有着不可替代的地位。其优势主要体现在遗传背景清晰、质粒载体种类丰富、发酵周期短以及高产量。常用的表达菌株如 BL21(DE3)，因缺失 Lon 和 OmpT 蛋白酶，能有效减少目标蛋白的降解；同时结合 T7 启动子系统，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，能够实现高水平的蛋白表达。这使得大肠杆菌非常适合科研和工业中的快速生产。

然而，大肠杆菌表达也存在一定局限。由于缺乏真核生物常见的翻译后修饰能力，某些复杂蛋白无法保持天然结构或活性。此外，高水平的表达常导致蛋白折叠不完全，形成包涵体，需要通过复性过程来恢复活性。同时，大肠杆菌的细胞壁中含有脂多糖（即内毒素），这在生产注射类蛋白药物时尤其需要去除，增加了下游纯化的复杂性。

枯草芽孢杆菌表达系统

作为一种革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌在蛋白表达方面具有独特优势。首先，它被美国食品药品监督管理局（FDA）认定为“普遍认为安全”的菌株，同时也获得了欧洲食品安全局的 QPS 认证，因此在食品和制药领域有广泛应用前景。其次，它不产生内毒素，这使得表达蛋白的下游纯化过程更加简便。更重要的是，枯草芽孢杆菌天然具有分泌能力，能够将目标蛋白直接分泌到培养液中，从而避免了复杂的细胞裂解和初步纯化步骤，大幅度提高了效率。

目前常用的表达质粒如 pHT01，含有强启动子 Pgrac，并且可通过 IPTG 诱导来实现高水平表达。据报道，目标蛋白可占细胞总蛋白的 16–30%。此外，通过在目标基因前端融合合适的信号肽，还可以实现高效的分泌表达，使目标蛋白直接进入培养液中。

但枯草芽孢杆菌系统仍有不足，例如遗传操作工具相对较少，表达的蛋白容易受到宿主自身分泌蛋白酶的降解。因此，研究人员通常会选择蛋白酶缺陷株或对培养条件进行优化，以减少蛋白降解。

原核蛋白表达系统构建与优化

在构建大肠杆菌表达系统时，常选用 pET 系列载体，将目标基因克隆至带有 T7 启动子的质粒中，通常还会加上多组氨酸标签（His 标签），便于后续纯化。诱导表达时，研究人员可以通过调节 IPTG 的浓度、培养温度和诱导时间来优化产量与可溶性。例如，在较低温度（如 16–20℃）下诱导，有助于目标蛋白折叠正确，从而减少包涵体的形成。

在枯草芽孢杆菌中，质粒设计时不仅要考虑启动子的选择，还需结合信号肽进行优化，以便实现分泌表达。此外，由于枯草芽孢杆菌与大肠杆菌在密码子使用偏好上存在差异，研究人员常采用密码子优化策略，以提高翻译效率。诱导方式除了 IPTG 外，还可利用木糖诱导系统等，从而实现更灵活的调控。

蛋白收获与纯化

大肠杆菌的蛋白收获通常需要先裂解细胞，常见方法包括超声波破碎和高压均质。随后，通过离心分离可溶性蛋白与包涵体，若目标蛋白主要存在于包涵体中，还需进行变性复性处理。纯化时，常利用亲和层析（如镍柱 IMAC 技术），通过 His 标签实现高效分离。为进一步提高纯度，还可结合凝胶过滤或离子交换层析。

枯草芽孢杆菌若选择分泌表达，则可直接从培养上清液中收集目标蛋白，省去了细胞裂解步骤，大大简化了流程。在这种情况下，利用亲和层析即可获得较高纯度的蛋白。由于不存在内毒素问题，下游处理更为简便，特别适合对安全性要求严格的应用。

蛋白纯化后的质量检测常用方法包括 SDS-PAGE 电泳以观察条带纯度，Bradford 法或紫外吸收法测定浓度，以及功能实验来验证蛋白的活性。

应用实例

在实验研究中，有学者报道从枯草芽孢杆菌 SXAU18 分离得到的抗菌蛋白 DarA，能够在大肠杆菌中实现可溶性表达，并且纯化后仍保持较强的抑菌活性。另一项研究中，利用蛋白酶缺陷株 WB800N 枯草芽孢杆菌表达来源于海洋生物的金属硫蛋白，获得了可溶性的融合蛋白，并成功验证其生物学活性。这些实例表明，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在不同应用场景下均具备独特优势。

原核蛋白表达与纯化技术已成为现代生物技术和工业生产的重要基础，凭借操作简便、周期短和成本低的优势，被广泛用于科研研究、药物开发及工业酶制剂生产。该技术的发展不仅推动了重组蛋白的大规模制备，也促进了下游纯化工艺的优化与标准化。随着分子生物学与合成生物学工具的不断进步，原核表达平台在蛋白折叠调控、分泌效率提升及功能保持等方面将持续突破，为高效、安全、可控的蛋白制备提供更加完善的解决方案。